[发明专利]一种双抗体复合的视黄醇结合蛋白检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学免疫体外诊断领域，特别是一种检测血清或尿液中的视黄醇结合蛋白测定试剂盒。

背景技术

视黄醇结合蛋白(RBP)为血液中视黄醇(维生素A)的转运蛋白。1961年Berggard在免疫电泳中发现在α₂-球蛋白区域能形成一条长沉淀线的蛋白质，曾称为长α₂-球蛋白。在以后几十年中，人们对这种蛋白质的分子结构、生物学特性等进行了全面研究，发现这种蛋白质广泛地分布于正常人体液中，属α₁-球蛋白，具有从肝细胞中转运视黄醇至周围组织的功能。现认为血液中RBP主要以视黄醇、前白蛋白结合的复合物形式存在，当复合物中视黄醇与靶细胞结合后，RBP便与前白蛋白分离，自肾小球滤出，由近端肾小管上皮细胞吸收、降解。近年来的深入研究表明RBP含量改变能够敏感地反映近端肾小管功能、肝功能损害程度，是反映肾脏、肝脏及营养性疾病发展、转归的敏感指标。

目前RBP的测定方法主要有酶联免疫法(EIA)、放射免疫法(RIA)及(ITA)，在上述三种方法中免疫透射分析法因其试剂稳定，操作自动化，检测结果快速、准确、可靠，因此成为临床实验室最具前景的测定方法。但目前市场视黄醇结合蛋白测定试剂盒由于抗体的纯度不够或效价达不到要求，同时，试剂配制过程中单纯采用一种抗体，导致试剂盒特异好而灵敏度不够，或灵敏灵较高但特异性较差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有试剂盒存在的缺陷，提供一种双抗体复合的测定试剂盒来检测血清或尿液中视黄醇结合蛋白的含量，以达到操作简便、灵敏度高、特异性好，快速，测定结果准确可靠的目的。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种双抗体复合的视黄醇结合蛋白检测试剂盒，由试剂R1、试剂R2及校准品三部分组成，试剂R1为磷酸盐缓冲体系，其组成为pH＝7.2-7.6的磷酸盐缓冲液35-60mmol/L、聚乙二醇6000-8000 60-95mmol/L和乙二胺四乙酸二钠6-13mmol/L；试剂R2为抗体液，其组成为鼠抗人单克隆抗体2-4ml/L(效价大于1∶128)、兔抗人多克隆抗体3-5ml/L(效价大于1∶16)、pH＝7.2-7.6的磷酸盐缓冲液35-60mmol/L和乙二胺四乙酸二钠6-13mmol/L；校准品为110mg/L人血清基质的冻干品，其还包括叠氮钠0.2-2.2％、吐温-20 1-10％、牛血清白蛋白1-3％，上述的百分比为人血清基质体积用量的百分比。上述的叠氮钠也可采用其他的防腐剂，吐温-20也可采用其他的稳定剂，牛血清白蛋白也可采用其他的表面活性剂。

本发明采用的复合抗体中羊抗人多克隆抗体效价大于1∶16，鼠抗人单克隆抗体效价大于1∶128，多抗保证线性与高值，单抗保证灵敏度与低值；高纯度、高效价的抗体可以采用单点定标线性模式在1-110mg/L内即可完全保证测定结果的准确性，操作较其它厂家试剂盒采用的多点定标模式简便、快速，节约成本，测定结果准确可靠。本发明采用多克隆抗体和单克隆抗体的复合抗体保证了灵敏度与高线性，与目前临床实验室所用的视黄醇结合蛋白试剂盒比较，测定结果准确性大大提高。

本发明中，对所述的抗体进行了纯化处理，其方法如下：用粗抗原或纯化抗原交联到琼脂糖凝胶4B制成亲和层析柱，将粗抗体通过所述的亲和层析柱，洗去未结合的非特异性蛋白，再用硫氰酸钾洗脱，洗脱流出液即为纯的多克隆抗体。亲和层析技术的应用，大大提高了抗体的纯度与效价，最大限度避免了非特异性反应，使结果准确性有了较大提高，精密度更好。

抗体的保存：冻干抗体具有稳定性好、保质期长等特点，适合于长期保存，配成试剂后可加适量甘油与牛血清白蛋白(BSA)作稳定剂。

本发明试剂盒的缓冲体系是PH值为7.2-7.6磷酸盐缓冲液，由于免疫复合物的形成有时限变化，当抗原抗体相遇后立即结合成小复合物(＜19S)，几分钟到几小时才形成可见的复合物(＞19S)。作为快速比浊测定，这种速度太慢，因此，加入聚合剂(或促聚剂)可加速大的免疫复合物形成。本发明加入促聚剂为多用聚乙二醇(MW6000～8000)，浓度约为4-6％。