[发明专利]一种黑热病媒介白蛉种类的鉴别方法及其鉴别试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种黑热病媒介白蛉种类的鉴别方法及其鉴别试剂盒。

背景技术

白蛉(Sandfly)是一种较小的双翅吸血昆虫，属于双翅目、白蛉科。本科白蛉特征是遍体生毛，体躯多作灰褐色，随种类与环境的变异而有深浅的不同，蛉体长约1.5～5.0mm，依种类而异。头部有1对大而黑的复眼；有长而分节的触角1对。蛉的胸背板上有1对翅狭而细长多毛呈桃叶状，停息时两翅向上展开，和它体躯成45°的角度。在胸腹板下附有3对长足，足上亦多毛，足呈银灰色闪光，印度的银足白蛉即以此特征而命名。雄蛉外生殖器显而易见。

根据Lewis(1977)和Lane(1993)，白蛉科下含6个属，其中有2个属的白蛉仅限分布拉丁美洲，在我国白蛉科下有3个属，即白蛉属、司蛉属和异蛉属。白蛉传播人及动物的各种利什曼病、白蛉热、东方疖、卡利翁氏病等，与人类密切相关的蛉种主要是白蛉属种类，在医学上极为重要。我国传播人际间利什曼病的白蛉媒介主要有四种，即中华白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉和长管白蛉。流行在华东、华北、陕西关中平原地区的人源性黑热病，系由家栖型中华白蛉作为传播媒介。在陕北、陇南川北、东北辽西等地区犬源性内脏利什曼病，系由野栖型或近野栖型中华白蛉为传播媒介。在新疆和内蒙古荒漠内黑热病自然疫源地，系由吴氏白蛉为传播媒介。在吐鲁番黑热病疫区内以亚历山大白蛉为传播媒介。在新疆南部人源性黑热病流行区内由长管白蛉为传播媒介。此外，在克拉玛依荒漠内吴氏白蛉还可以作为由婴儿利什曼原虫引起的皮肤利什曼病的传播媒介。在大砂鼠体内寄生着对人不致病的大砂鼠利什曼分布区内，其传播媒介在甘肃为蒙古白蛉和亚历山大白蛉；在新疆为蒙古白蛉和高加索白蛉。在新疆蜥蜴利什曼原虫分布区内则以微小司蛉新疆亚种为传播媒介。

白蛉的生活史是属于完全变态，除成虫吸血外，其卵、幼虫、蛹均在土壤内孳生，幼虫的越冬期很长。阴暗、润湿、富含有机物质的土壤内均适于白蛉的孳生。家栖种类的白蛉幼虫以屋内土壤为其主要孳生场所；野栖蛉种则以野外各种啮齿动物洞穴为其理想的孳生场所。白蛉偏野习性，除极少数蛉种可在实验室内建立循环、繁殖后代，绝大多数白蛉很难在实验室内长期传代循环。白蛉的分类主要是白蛉成虫的分类。长期以来，白蛉的分类鉴定工作主要是以成虫内、外部形态特征为依据进行的，已形成其传统的分类体系。由于白蛉个体微小、种间形态近似以及种下多型现象，现用形态分类方法对其鉴别需要较高的解剖技能，以及研究者的多年经验，因此常受标本状态、环境条件，研究者主观经验的影响较大。同时在黑热病媒介监测调查中，常常需要人工大量解剖白蛉，从白蛉内部的咽甲、受精囊、尾器等形态学特征来判别该地区的白蛉种类及其组成，不仅费时费力，对于保存不善的白蛉标本常常无法确定其种类。根据遗传本质DNA为依据来阐明物种间的差别，从分子水平上鉴别物种，其结果客观，灵敏准确度高，能弥补传统形态学一些重要不足。近年来分子鉴别技术在同属双翅目的蚊科中已得到广泛应用，主要的技术有随机扩增多态(random amplified polymorphism DNA，RAPD)、限制性酶切片断多态(restrictionfragment length polymorphism，RFLP)，DNA单链构象多态(single strand conformationpolymorphism，SSCP)，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和DNA测序等技术，这些技术方法目前已经日趋成熟和稳定，经过科学家们广泛研究证实，核糖体基因(ribosome DNA，rDNA)是分子鉴别和分子系统学研究的较理想的分子指标。

本发明以我国白蛉属四种白蛉(中华白蛉，吴氏白蛉，长管白蛉和亚历山大白蛉)为材料，依据分子特征核糖体DNA第2内转录间隔区(rDNA-ITS2)序列，提供一种有效的分子鉴别方法及鉴别试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是克服传统白蛉种类鉴别方法的不足提供一种简单快速、灵敏、特异的黑热病媒介白蛉种类的分子鉴别方法。

本发明所提供的白蛉种类的分子鉴别方法，包括下列步骤：

(1)白蛉DNA抽提；