[发明专利]一种制备高纯度胰激肽原酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胰激肽原酶的制备方法，具体地说是涉及一种采用亲和层析法生产高纯度胰激肽原酶的制备方法；属于生物制药领域，涉及到药用蛋白酶的生化分离技术。

背景技术

胰激肽原酶是从猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶，它在药理和临床上的功用主要为：胰激肽原酶是一种具有扩张血管改善微循环作用的周围血管扩张药；它能够激活纤溶酶，抑制磷脂酶A2，具有降低血粘度，防止血小板聚集，防止血栓形成等作用。其主要用于微循环障碍性疾病，如糖尿病引起的肾病、周围神经病、视网膜病、眼底病及缺血性脑血管病的治疗，也可用于高血压病的辅助治疗。

现有胰激肽原酶的纯化方法一种是使用多糖非树脂物料进行纯化，例如使粗的胰激肽原酶吸附到一种弱碱性阴离子交换纤维素上并分离；或者将一种铝盐或者锌盐加入含有胰激肽原酶的水溶液中，将产生的胰激肽原酶的沉淀吸附到弱碱性的阴离子交换纤维素上或交联葡聚糖上，并分离之；另一种纯化方法是使用离子交换树脂，即加入一种蛋白质沉淀剂到胰脏提取液中，产生的胰激肽原酶吸附到大孔强碱性阴离子交换树脂，并分离之。然而，利用上述多糖型非树脂物料进行吸附的方法缺点是离子交换物料的物理强度不够，不能进行大规模制备。而离子交换树脂法不能使产品在洗脱时除去不需要的杂质。因此，上述方法得到产品的纯度还有待于进一步提高。

胰激肽原酶最初收载于中国卫生部药品标准二部第六册(生化药品)(1998年)中，该标准中规定胰激肽原酶的比活按干燥品计算不得小于300单位/毫克蛋白，2006年国家药典委员会对该标准进行了修订，增加了纯度指标，规定供口服用胰激肽原酶的纯度不得低于65％。这一指标的制定从一定程度上提高了对胰激肽原酶的品质要求，但是由于目前国内生产胰激肽原酶工艺水平不高，产品纯度所能达到的程度不均衡，质量稳定性差，因此在制定纯度限度要求时，对纯度要求只有65％。最新发布的中国药典2010版中将胰激肽原酶作为新品种收录其中，对纯度要求做了修订，胰激肽原酶的纯度要求也仅提高到70％。

根据分析，胰激肽原酶工艺未获得重大突破的原因有三：一是生产厂家的工艺惯性，工艺一旦稳定不轻易变动；二是几年前胰激肽原酶在临床上的应用主要是用作口服制剂等，对产品的质量要求没有那么高；三是亲和层析技术本身的技术难度使得开发以亲和层析工艺来制备胰激肽原酶的技术不是那么容易。

可是近年来国际研究发现，胰激肽原酶静脉注射可舒张脑血管、增加脑血液中血红蛋白含量，降低脑梗塞面积的扩展，改善梗塞引起的脑组织葡萄糖和氧摄取降低，改善葡萄糖代谢，并可改善自发性皮层脑电图异常，用于治疗轻/中度急性血栓性脑梗死，这个应用使得国际市场上对本产品的需求不断扩大，而从质量要求上却更加严格，要求产品有更好的品质，传统工艺生产的胰激肽原酶显然已经不能满足这种需求。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工艺稳定、质量保证的制备高纯度胰激肽原酶的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种制备高纯度胰激肽原酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)原料磨碎、加热反应：用研磨设备将新鲜冷冻猪胰直接磨成浆状，控制温度为40-60℃，加热搅拌反应4-5h，放置过夜，得到反应液；

(2)提取：将反应液泵入提取桶，将反应液、纯化水和丙酮按体积比1∶3∶1混合，搅拌3-4h，再经过固液分离装置得到清液；

(3)盐析：向步骤(2)得到的清液中加入硫酸铵至30％饱和度，在4℃冷库中放置过夜后过滤，得到提取液，在提取液中再补充硫酸铵至70％饱和度，在4℃冷库中放置过夜，弃去上清液后用离心法收集底层沉淀，得到粗品；

(4)亲和层析分离纯化：将得到的粗品用纯化水溶解得到溶解液，将亲和层析介质装入分离柱，用缓冲液进行平衡后用溶解液上样，控制流速在30cm/h，上样完毕后继续用缓冲液冲柱至流出液的OD₂₈₀值小于0.1；换用pH为7.0，浓度为0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)及0.5mol/L KCl的混合缓冲液继续洗脱，控制流速为50cm/h，收集洗脱峰；

(5)超滤浓缩除菌：对收集到的洗脱峰采用超滤膜进行浓缩，得到的浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌得到酶液；

(6)真空冷冻干燥：将步骤(5)中得到的酶液置于冻干盘中，通过真空冷冻干燥对酶液进行冷冻干燥，即得到产品。

所述的步骤(2)中固液分离装置为机电一体化箱式板框过滤设备。