[发明专利]家畜驴的一种抗微生物肽Ea-CATH1及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明提供家畜驴(Equus asinus)的一种cathelicidin家族广谱抗微生物肽Ea-CATH1及其基因和应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

Cathelicidin是一类由N端信号肽区域、中间保守cathelin结构域和C端高度特异的成熟肽区域构成的具有多功能的抗菌肽家族，在几乎所有种类的动物体内(哺乳类、鸟类、两栖类和鱼类)都有发现。与防御素(defensin)一样，Cathelicidin是包括人类在内的大多数脊椎动物所特有的宿主防御肽，构成了脊椎动物自然免疫反应的关键组分，是连接自然免疫和特异性免疫的桥梁。Cathelicidin具有广谱的抗菌活性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌以及病毒具有非常强的杀菌活性，而且对许多临床耐药细菌同样具有作用。除此之外，Cathelicidin还具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞(中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞和T细胞)具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。Cathelicidin基因的缺失或异常表达都将导致人类严重疾病的发生。最新研究发现，系统性红斑狼疮和牛皮癣的发病与人体内Cathelicidin LL-37的过度表达有关。由于具有如此众多的活性，Cathelicidin一直是国际上研究的热点。针对Cathelicidin的药用开发则蕴含着巨大的临床治疗药物制备价值。

由于近年来抗生素的滥用，导致致病性微生物耐药性的问题日益严重，在临床上已经出现了大量能够完全耐受青霉素等传统抗生素的微生物。Cathelicidin成熟肽表现抗微生物肽的典型特征：大多数Cathelicidin成熟肽分子量小于5000，中性pH条件下带净正电荷，缘于它们含有多个碱性氨基酸残基；富含疏水碱基，整体具有两亲性的拓扑结构。体外抗微生物测试中，大多数Cathelicidin成熟肽可以在微摩尔和亚微摩尔的浓度下快速杀死广泛的微生物。Cathelicidin抗微生物肽的杀菌机制是通过破坏细菌细胞膜的完整性介导的：通过静电相互作用吸引并结合到带负电的细菌细胞膜表面，进一步在细菌细胞膜上形成跨膜的孔洞，导致细菌细胞内容物的外泄，从而导致细菌细胞的死亡。而传统抗生素主要是作用于细菌细胞内的一些酶类。正是由于作用方式的不同，Cathelicidin介导的杀菌作用远远快于传统抗生素，并且不易产生耐药性。除此之外，越来越多的文献报道表明抗菌肽还具有其他的杀菌机制，如抑制细菌细胞壁合成、改变细菌细胞质膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制细胞内酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白质的合成等。

目前，国外有许多公司正在进行抗微生物肽的研究开发，已有多种抗菌肽进入临床试验阶段。如来源于人lactoferrin的hLF-1-1用于治疗骨髓干细胞移植相关的感染，已进入临床II期。来源于非洲爪蟾magainin的MSI-78对糖尿病患者的足部溃疡有显著疗效且副作用小，已进入临床III期试验阶段。来源于猪protegrin的IB-367用于治疗肿瘤患者口腔溃疡，已进入临床I期试验。除此之外，一些用于伤口愈合，内毒素感染，肿瘤，病毒感染的抗菌肽也已进入临床试验阶段。

由于世界范围内对Cathelicidin的研究历史并不长，我国在此类活性多肽家族的研究还鲜有报道。家畜驴是我国本土养殖的具有多种经济价值的大牲畜之一，全国范围分布的大大小小的肉驴养殖场多达上千家。由于驴的饲养成本低，驴肉本身的营养价值高，所以驴肉生产是一项极具开发潜力的新型肉食品，此外，驴是具有较高药用价值的动物，肉用驴的皮经煎煮浓缩制成的固体胶称阿胶，又称驴皮胶，是我国的传统中药材。其肉、皮、骨、毛、蹄、阴茎、脂肪和乳亦可以入药。然而，对其活性成分和药理性质的研究主要集中于有机小分子，对其活性蛋白肽类物质研究还尚未有报道。

本发明的家畜驴抗微生物肽Ea-CATH1分子量更小，比至今已经鉴定的大多数cathelicidins均小(如金环蛇cathelicidin-BF 30个氨基酸，鸡fowlicidin232个氨基酸等)。杀菌作用更强(相比较于传统抗生素氨苄青霉素和卡那霉素，及人cathelicidin LL-37)、更广谱，对多种临床耐药菌有非常强的杀灭作用。结构简单，不含有二硫键及环状结构。杀菌动力学数据显示其杀菌作用时间迅速、且对多种临床耐药菌有非常强的杀灭作用。此外还具有无溶血性、及超强的血清稳定性等有益特点。

发明内容