[发明专利]沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒及其制备方法

权利要求书

1.一种沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒，其特征在于：在质粒载体pIRES-EGFP中包含细胞因子信号抑制因子1小干扰RNA片段，肿瘤相关抗原NY-ESO-1全长编码序列、MAGE-3表位p271-279编码序列，HMGB1的编码序列，并在HMGB1序列N端添加了人胰岛素信号肽序列，该质粒的碱基序列见序列表。

2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于：细胞因子信号抑制因子1的shRNA由人U6RNA启动子控制；编码NY-ESO-1和MAGE3融合蛋白的序列由CMV启动子控制，HMGB1基因位于CMV启动子下游，由一个内部核糖体进入位点启动转录。

3.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于：该质粒转染入树突状细胞，通过沉默细胞因子信号抑制因子1，分泌表达HMGB1和胞内表达肿瘤相关抗原NY-ESO-1、MAGE-3，刺激树突状细胞成熟，增加树突状细胞因子分泌量，并使树突状细胞疫苗具有更加有效的免疫刺激能力，增强树突状细胞疫苗对肿瘤的特异性。

4.如权利要求1所述沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒的制备方法，其特征在于：该质粒是按以下步骤制备的：

①.细胞因子信号抑制因子1沉默质粒的构建，设计并合成用以敲减细胞因子信号抑制因子1基因表达的shRNA oligo序列，分别合成并经退火形成的oligo双链连入pENTR/U6载体中；

②.高迁移率族蛋白B1表达质粒的构建，以P1-sig、P2-NotI为引物，HMGB1 ORF克隆为模板扩增带有信号肽序列和NotI的HMGB1序列；以P3-EcoRI、P4-sig为引物pIRES-EGFP载体为模板扩增带有EcoRI和信号肽序列的IRES序列，将上述两段产物以PCR方法拼接为IRES-胰岛素信号肽-HMGB1；

③.肿瘤相关抗原表达质粒的构建，以P5-EcoRI，P6-NotI为引物，NY-ESO-1ORF克隆为模板扩增带EcoRI位点和MAGE3-NotI的NY-ESO-1序列，利用NotI和EcoRI酶切位点将PCR扩增产物装入载体中后经转化感受态细菌，克隆扩增提取质粒；

④.共表达高迁移率族蛋白B1和肿瘤相关抗原质粒的构建，以P7-BglII，P8-EcoRI为引物，第③步构建的质粒为模板扩增带有BglII和EcoRI识别位点的NY-ESO-1-MAGE序列，将扩增片段利用BglII和EcoRI装入第②b步所构建的质粒中后经转化感受态细菌，选择性培养基克隆扩增提取质粒；

⑤.沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒的构建，以P9-BasI，P2-NotI为引物，第4d步骤所构建质粒为模板扩增带有BasI和NotI酶切位点的CMV+NY-ESO-1-MAGE3表位-I RES+胰岛素信号肽-HMGB1片段，以P10-BfaI，P11-BsaI为引物，以第①步所骤构建的质粒为模板PCR扩增带BfaI和BsaI位点的U6-shSOCS1序列，上述两段PCR产物利用BsaI酶切后连接后利用AseI和NotI装入pIRES-EGFP载体中，经转化感受态细菌，选择性培养基挑取阳性克隆扩增提取质粒后测序；

⑥.质粒鉴定，沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒转染293T后，经western blot验证，正确表达NY-ESO-1蛋白，转染PC3细胞后，细胞因子信号抑制因子1蛋白表达明显较野生型PC3及shNC/EGFP转染组降低。