[发明专利]一种含贝母的中成药中川贝母的分子生物学鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于中药鉴定技术领域，具体地说是一种基于基因组RAPD分析的、用于各种含贝母的中成药中川贝母的分子生物学鉴定方法。

背景技术

贝母为百合科Liliaceae贝母属Fritillaria L.多种植物的干燥鳞茎，是常用中药之一，2010年版《中华人民共和国药典》收载贝母分为五大类：川贝母、湖北贝母、平贝母、伊贝母、浙贝母，其中川贝母为百合科植物卷叶贝母F.Cirrhosa D.Don、暗紫贝母F.unibracteata Hsiaoet K.C.Hsia、甘肃贝母F.przewalskii Maxim.ex Batal、梭砂贝母F.delavayi Franch、太白贝母F.taipaiensis P.Y.Li和瓦布贝母F.wabuensis S.Y.Tang et S.C.Yueh的干燥鳞茎。

由于川贝母疗效良好及资源稀少等原因，始终是贝母类药材中最为昂贵的品种，因此药材市场上以及各种含贝母的中成药中也屡见用其他贝母冒充川贝母的现象。常规的性状、显微以及理化鉴定方法不能将它们区别开，而分子生物学技术的快速发展使得各种贝母的准确鉴定成为了可能。

目前对于川贝母的DNA分子鉴定，有采用聚合酶链反应-限制性酶切图谱鉴定方法PCR-RFLP(中国发明专利CN03131798.7)和特异引物PCR方法(Planta Med 2003；69：184-186)，前者可将川贝母与其他贝母药材区别开，后者能鉴别卷叶贝母。但是，这些方法对供试材料的要求较高，只能鉴定新鲜鳞茎和叶子，而不能对各种含贝母的中成药，如片剂、散剂、丸剂等制剂中原料药材进行准确鉴定。因此寻找鉴定中成药中川贝母的方法具有重要的意义。

发明内容

本发明公开了一种基于基因组RAPD分析的含贝母中成药中贵重原料药川贝母的鉴定方法，它克服了常规鉴定方法如性状、显微、理化鉴定的不足。

本发明含贝母中成药中川贝母的鉴定方法包括：建立川贝母的随机扩增多态DNA标准图谱和待鉴定中成药随机扩增多态DNA图谱，将两者进行比对，在待鉴定中成药随机扩增多态DNA图谱中找到与标准图谱对应的条带，则判定待鉴定中成药中贝母成分为川贝母，反之则不是川贝母。

上述方法中，建立随机扩增多态DNA图谱的方法包括：

a、标准品或中成药经处理粉碎成细粉后，预处理除色素，用CTAB法提取各基因组DNA。

b、将所提取基因组DNA进行聚合酶链式反应，得到随机扩增多态DNA产物。

c、用琼脂糖凝胶对随机扩增多态DNA产物进行电泳，电泳后在紫外光下照相，这一步骤也是本领域常规的方法，采用标准品的则得到随机扩增多态DNA标准图谱，采用待鉴定中成药的则得到待鉴定中成药的随机扩增多态DNA图谱。电泳较好的方法是：用1.5％的琼脂糖凝胶分别对随机扩增多态DNA产物进行电泳分离，Gel Rad^TM直接加在凝胶中，上样量10μL，加2μL 6×凝胶加样缓冲液，100V下恒压电泳1h。电泳结束后用Gel Doc 2000在紫外光下照相。

本发明中，基因组DNA预处理优选的方法是：经组成为200μmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH 8.0；50μmol/L乙二胺四乙酸，pH 8.0和250μmol/L氯化钠的TNE液和2％的β-巯基乙醇冰浴30min。

本发明中，优选的提取基因组DNA的CTAB提取液为：4％十六烷基三甲基溴化铵；100mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH 8.0；20mmol/L乙二胺四乙酸，pH 8.0；1.4mol/L氯化钠；9％聚乙烯吡咯烷酮；0.1％β-巯基乙醇和0.1％牛血清白蛋白。优选的水浴温度为90℃，水浴时间2h。提取过程中加入1/3体积醋酸钾冰浴去蛋白，沉淀DNA时加入1/2体积的5mol/L氯化钠使多糖尽可能留在溶液中。

本发明中，优选的聚合酶链式反应条件如下：10×聚合酶链式反应缓冲液2.5μL；浓度为1U/μL的Taq DNA聚合酶1.5μL；浓度为25mmol/L的氯化镁2μL；浓度为10μmol/L的随机扩增多态引物0.75μL；浓度为10mmol/L的dNTPs 0.75μL；模板DNA 1.5μL；灭菌超纯水16μL。

本发明中，优选的聚合酶链式反应扩增程序如下：95℃预变性4min；94℃变性45s，40℃退火60s，72℃延伸90s，扩增40个循环；最后于72℃延伸10min补齐反应。