[发明专利]一种高效介导DC基因转移的重组腺病毒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体为一种高效介导DC基因转移的重组腺病毒。

背景技术

自1973年Steinman和Cohn首次报道树突状细胞(Dendritic cell，DC)以来，人们对DC的认识不断深入。目前认为DC是人体内最重要，抗原递呈能力最强，体内唯一能活化静息T淋巴细胞的抗原递呈细胞，是机体免疫应答的始动者，它具有摄取、加工抗原，以主要组织相容性复合物(MHC)I、II类肽复合物的形式递呈抗原，促进T、B淋巴细胞增殖的能力，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着极其重要的作用。

研究表明，肿瘤的发生、发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关，特别是晚期肿瘤患者，其体内往往存在体液免疫和细胞免疫功能的普遍低下，且其低下程度与其临床分期密切相关。进一步的研究发现，导致免疫功能低下的根本原因在于机体对成熟DC的功能下调。体外实验证实即使由晚期肿瘤患者体内分离出的淋巴细胞对多种外界刺激仍然保持着很好的反应能力。因此，通过体外培养DC，制备DC瘤苗免疫荷瘤宿主，有望成为肿瘤的理想疗法。

基因修饰免疫细胞是目前肿瘤治疗研究领域的热点之一，其具体策略是通过基因转移技术将目的基因导入免疫细胞，然后将表达目的基因的免疫细胞输入患者体内，从而提高免疫系统对肿瘤细胞的识别或杀伤能力。基因修饰DC介导的肿瘤治疗成为当今肿瘤生物治疗领域中备受关注的焦点之一。

有效的基因治疗依赖于外源基因高效、稳定的表达。肿瘤抗原基因导入DC的方法一般有两大类：一是以腺病毒、逆转录病毒、痘病毒和腺病毒相关病毒等为载体的病毒载体方法；二是DNA脂质体复合物、磷酸钙沉淀、电穿孔等非病毒载体方法。非病毒载体方法转染的优势在于：插入片段大小不受限制；免疫原性低；生产简便。其缺点是外源基因的转染效率一般很低。病毒载体介导方法，以其高转染率和良好的靶向性成为肿瘤基因治疗中应用最广泛的方法。利用病毒载体将带有肿瘤抗原的编码基因转染DC制备的疫苗，由于可以在DC细胞内加工和持续表达相应特异性抗原，诱导产生特异性抗肿瘤免疫应答而备受关注。其中最常用的包括逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)和腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)等载体。

逆转录病毒可将转染的基因整合到染色体上，因此可以保证转基因的长期表达，但这种整合是随机的，可能导致细胞突变而诱发癌症；逆转录病毒只感染分裂细胞；用逆转录病毒载体介导外源基因转染DC的效率只有10％～30％，因此，介导肿瘤基因治疗存在一定的局限性。在法国进行逆转录病毒为载体的人类基因治疗临床研究出现了诱发血液系统恶性肿瘤的严重问题。

腺病毒是众多的病毒载体基因转移方式中最常见的，其优点在于：安全，有效；腺病毒可以通过上调DC细胞表面的MHC及共刺激分子表达来促进其成熟；插入的外源片段大小可达37kb；腺病毒转染后的DC可以保持正常的表型特征和功能；体内回输在肝脏短暂停留后移行到脾脏并持续表达外源基因，血清中不产生抗Ad抗体。美国Genzyme公司和麻省总医院MGH的学者也探索了腺病毒介导的gp100基因转染的小鼠骨髓来源DC的性质，并通过小鼠体内实验证明gp100基因修饰的DC体内免疫后可诱导出gp100特异性CTL。国内章卫平等也报道了腺病毒介导的GM-CSF基因修饰的DC与肿瘤细胞的融合疫苗体内免疫激活效果的研究结果。

腺病毒进入细胞主要由纤维顶球与细胞表面受体的相互作用所介导，所以传统的5型腺病毒对DC的感染效率比较低。因此，对其亲嗜性的修饰对于基于DC的基因治疗的发展无疑起着重要作用。AdEasy腺病毒制备系统是实验室普遍使用的腺病毒包装系统，我们基于此系统对5型腺病毒纤维基因进行修饰，将AdEasy-1载体中5型腺病毒的纤维顶球和柄部替换为11p型腺病毒的相应部分。通过这种方法改构腺病毒，不仅可以提高重组腺病毒对DC的感染效率，而且还可以实现纤维基因与目的基因在不同的载体同时进行操作。

综上所述，制备一种能够高效感染DC的重组腺病毒，为肿瘤的基因治疗提供一种特异、高效的方法，具有重大的理论和现实意义。

发明内容

本发明的目的是在于建立一种能够高效介导DC基因转移的腺病毒制备体系，为基于DC的靶向基因治疗提供一种新的策略。