[发明专利]水体致突变性检测的Ames实验微量波动法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种水体致突变性检测的Ames实验微量波动法，属于微生物技术领域。

背景技术：

一般认为，85％-90％的化学致癌物为致突变物。由于Ames试验的重现性好，预测已经在啮齿类动物中发现致癌作用的准确性较高。因而，Ames试验作为任何致突变筛选计划中不可缺少的一部分。

1976年Green[1]发明的波动试验和传统致畸变检测Ames试验均以细菌回变作为检测终点，且在已知诱变剂的测试中，发现它能在更低的浓度下获得阳性反应结果。后来，Gatehouse将波动试验改良为微量法，这一创举不仅大大减轻了工作量，而且进一步提高了波动法的灵敏性。国内有关于微量波动法实验体系组氨酸浓度，细菌浓度，生物素浓度的报道[2]。上述方法在鼠伤寒沙门氏菌不同菌株间无通用性，并且存在待测物处理繁琐等问题。

参考文献：

1.Green，MHL，WJ M.Mutagen testing using trp+reversion in Escherichia coli.Mutat Res 38(3)：32，1976.

2.胡长灯，詹卓玲.微量波动试验的影响因素及灵敏度研究.卫生毒理学4(2)：115-116，1990.

发明内容：

本发明的目的在于克服现有微量波动法检测方法的不足，而提供一种通用于鼠伤寒沙门氏菌不同菌株的测试体系，并使待测物处理变得简单的水体致突变性检测的Ames实验微量波动法。

本发明方法是在现有微量波动法检测方法基础上的改进。本发明方法阐述了TA97、TA98、TA100，TA102系列菌株的最佳反应条件。具体通过采用鼠伤寒沙门氏菌TA98菌株为测试菌株，二氨基芴为阳性物，通过实验设计，分析体系中不同菌液浓度、不同S9浓度，不同阳性物浓度的实验结果，确定了该方法的最佳反应剂量，并通过对TA97，TA100，TA102菌株反应情况分析，验证了反应体系的通用性。

本发明相对于现有微量波动法检测方法改进点有如下几个方面：

1、生长培养液：生物素0.8ug/ml，组氨酸0.2ug/ul，葡萄糖16mg/ml，溶于Vogel-Bonner缓冲液。

2、溴甲酚紫(BCP)：0.15g溴甲酚紫溶于30ml Vogel-Bonner缓冲液，制得5ug/ml的溴甲酚紫指示剂，微孔滤膜过滤除菌备用。

3、反应体系中细菌浓度10ul/ml，S9浓度为40ul/ml。

4、采用待测物暴露细菌24小时，加入显色剂继续培养48或72小时后观察结果，即阳性孔数。

5、以浓度为横坐标，阳性孔数的对数为纵坐标作图，采用常规的线性回归分拟合直线，通过常规的线性方程的计算，以斜率为依据判定待测物致畸变强度，斜率越大，即相对致突变能力越强。

本发明的方法用于水质及食品等的致突变性检测，具有快速、操作简便的优点，有良好的应用前景。

附图说明：

图1为不同剂量阳性物反应结果示意图。

图2为不同反应时间下反应结果示意图。

图3为不同菌浓度条件下反应结果示意图。

具体实施方法：

1、菌株：

用鼠伤寒沙门氏菌MOLTOX标准菌株TA98，TA97，TA100，TA102，培养至菌浓度为10⁸。

2、S9辅助因子混合液：

制备方法依照：中华人民共和国国家标准-鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验。

3、10％S-9混合液(活化系统)：

每10ml含无菌的0.2mol/l磷酸盐缓冲液(PH6.4)6.0ml，1.65mol/l氯化钾溶液0.2ml，0.4mol/l氯化镁溶液0.2ml，0.05mol/l葡萄糖-6-磷酸盐溶液1.0ml，0.025mol/l辅酶-II溶液1.6ml和大鼠肝匀浆液(S-9)1.0ml，混匀。

4、溶液：

Vogel-Bonner缓冲液贮备液(50倍)：磷酸氢钠按16.5g，柠檬酸10.0g，磷酸氢二钾50.0g，硫酸镁1.0g，加蒸馏水至100ml，溶解后灭菌。

5、生长培养液：生物素0.8ug/ml，组氨酸0.2ug/ul，葡萄糖16mg/ml，溶于上述VB buffer。

6、溴甲酚紫(BCP)：

0.15g溴甲酚紫溶于30ml Vogel-Bonner缓冲液，制得5ug/ml的溴甲酚紫指示剂，微孔滤膜过滤除菌备用。

7、阳性物：二氨基芴。