[发明专利]高效解磷的丁酸梭菌A5-4及应用

说明书

技术领域

本发明属农业微生物技术领域，具体涉及一株丁酸梭菌，尤其是涉及一株可在厌氧条件下高效溶解磷酸钙和植酸钙的丁酸梭菌的分离筛选，其制备方法与用途。

背景技术

磷对植物的生长发育至关重要，而磷供给不足已逐渐成为限制农业产出的最重要因素之一。土壤中总磷含量大约为0.04～0.1％，但是只有其中的1.0～2.5％能够被植物吸收利用，绝大多数为无效态(难溶态)在土壤中积累，很难被植物直接吸收利用。为解决磷素缺乏获得高产，全球每年施用将近3000万吨磷素化肥，但是其中的80％由于吸附、沉积或固定为植物难以吸收利用的无效磷，磷肥的低利用率使得农田中施用的磷肥越来越多，不仅提高了农业成本，还造成了严重的环境及生态问题。

解磷微生物是土壤中能够将无效磷转化为植物可以吸收利用的有效磷的一类特殊微生物功能群体，在自然及农业生态的磷素生物地化循环中起到了关键作用；它们通过酸解、螯合、置换及分泌磷酸酶等方式将无效磷转化为能被植物利用的有效磷(主要是HPO₄^2-和H₂PO^4-形式)。大量研究表明，施用含有解磷菌的微生物肥料对促进植物生长、改善土壤结构效果显著。因此研究新型、高效的解磷微生物，以保持农业生态环境的平衡，对发展持续高效农业具有深远的战略意义。

土壤中的无效磷包括无机磷和有机磷，而有机磷又主要以植酸盐的形式存在于动物粪便、农业副产物、生活垃圾中。农业中施入的磷肥和有机磷源有很大部分随雨水、灌溉进入厌氧环境，成为难被作物利用的无效磷。目前研究的解磷菌主要是好氧菌，而对厌氧解磷菌的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株可以在厌氧条件下溶解磷酸钙和植酸钙的细菌，该菌株能够有效提高土壤中的有效磷含量，促进植物生长，从而提高磷肥的利用率，节约磷矿资源，改善生态环境，确保农业生产的可持续发展。

本发明的技术方案如下

本发明通过分离筛选得到一株一株该菌株高效解磷的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)A5-4，该菌株已于2010年3月12日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为：CCTCC NO：M2010052。该细菌分离自化粪池底泥中，在厌氧条件下具有高效溶解磷酸钙和植酸钙的能力。该菌营养需求范围广、易培养、成本低、耐储存，重新施入环境中也不会导致环境污染。本发明的菌株能够开发成一种新型的应用于水生作物栽培或水产养殖的微生物菌剂。

本发明分离的丁酸梭菌A5-4的生物学特征：

本发明分离的丁酸梭菌A5-4，为革兰阳性厌氧菌，菌体初期杆状，产芽胞，芽胞中生，菌体中部膨大而呈梭状；RCM培养基上菌落呈圆形、乳白色、边缘整齐、表面光滑。本发明的丁酸梭菌A5-4株与丁酸梭菌标准株(Clostridium butyricum)主要生物学特征对比见表1。丁酸梭菌A5-4的16SrDNA序列在NCBI GenBank中的序列号为：GU227149。其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：1所示。

申请人提供了一种丁酸梭菌的制备方法，其步骤如下所述：

制备丁酸梭菌A5-4一级种子液：取甘油管保藏的保藏号为CCTCC NO：M2010052的丁酸梭菌菌种A5-4200μL，接种于装有15ml RCM液体培养基的试管中，于35～45℃下静置培养8～12小时，得到丁酸梭菌A5-4一级种子液，一级种子液的活菌数≥3×10⁸个/mL；

制备丁酸梭菌A5-4二级种子液：将丁酸梭菌A5-4一级种子液按体积份3～5％接种量接入装有丁酸梭菌A5-4二级种子培养基的培养瓶中，于35～45℃下静置培养8～12小时，制成丁酸梭菌A5-4二级种子液，二级种子液的活菌数≥2.5×10⁸个/mL；

丁酸梭菌A5-4发酵培养：将丁酸梭菌A5-4二级种子液按体积份3～5％接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中于35～45℃下静置培养48～72小时，发酵液中的丁酸梭菌A5-4的活菌数≥1×10⁹个/mL；

其中

丁酸梭菌A5-4RCM液体培养基的组分及其配比如下：

葡萄糖5.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉3.0g，胰蛋白胨10.0g，可溶性淀粉1.0g，醋酸钠3.0g，NaCl 3.0g，补充蒸馏水至1L，调pH至7.0～7.5。

丁酸梭菌A5-4二级种子培养基的组分及其配比如下：