[发明专利]固定化过氧化物酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于环境科学领域，涉及一种新型环境功能材料，具体地说是一种 以纳米磁铁颗粒为载体的固定化过氧化物酶的制备方法。

背景技术

酶的固定化是指通过物理或化学的方法将酶分子固定到载体表面。固定化 酶的制备方法有物理法和化学法两大类。主要的物理固定方法有吸附法、包埋 法。吸附法操作简单，条件温和，不会引起酶的变性失活，但酶与载体结合部 不太牢固而易脱落。包埋法虽然可以固定大量的酶，但酶在底物反应过程中造 成较大的传质阻力。化学固定法是目前应用最多的酶固定化技术，酶与载体结 合牢固，制得的固定化酶稳定性好，但制备过程中反应条件较为强烈，难以控 制，最终可能导致酶被固定化后失活较为严重。

层层自组装技术是基于静电相吸而产生多层膜自组装体系的技术，通过轮 流地交换吸附溶液，使两种带相反电荷的离子相互吸引结合构成多层膜结构。 具体而言就是将底物上带有电荷的聚合物表面连续而又交替地沉浸在带有完全 相反电荷的两种溶液中，利用静电相吸的作用，使带不同电荷的两种物质有序 而紧凑地连接在一起，重复数次得到多层膜结构。该技术在材料、生物和药物/ 基因释放等领域得到了广泛的应用。但迄今为止，层层自组装技术在环境科学 领域的应用还是空白。

发明内容

本发明针对上述问题，提供一种固定化过氧化物酶的制备方法，该方法利 用层层自组装技术制备固定化过氧化氢酶，制得的固定化过氧化氢酶活性高、 稳定性好。

按照本发明的技术方案：一种固定化过氧化物酶的制备方法，包括以下步 骤：

a.载体的预处理：用超声波将磁铁颗粒按质量体积比为1∶10～1∶20的比 例分散到含20g/L壳聚糖和1％冰醋酸的溶液中，混合均匀，充分搅拌下逐滴加 入含乳化剂的石蜡油，继续搅拌，加入戊二醛溶液作为交联剂，40℃下反应1h， 然后加入适量NaOH溶液，调节pH至9～10，用石油醚或乙醇洗去多余的壳聚 糖和石蜡油，干燥后得到表面包裹壳聚糖的磁铁颗粒；

b.成膜材料的选择：选择聚磺化苯乙烯钠盐和聚盐酸烯丙胺分别作载体的 A层膜电解质材料和B层膜电解质材料，用10mmol的醋酸缓冲液配制浓度为 2％～5％的聚电解质溶液，加0.05％～0.08％NaCl溶液控制聚电解质溶液的离子强 度；

c.配置过氧化物酶溶液：用pH4.5～5.5醋酸缓冲液配制酶活力为250U/mg 的过氧化物酶溶液；

d.静电交替沉积：

A层膜的吸附：将载体置于A层膜聚电解质溶液和过氧化物酶溶液的混合 溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表面，吸附20min～60min 后，用缓冲液冲洗2min～20min；

B层膜的吸附：将经过A层膜吸附后的载体置于B层膜聚电解质溶液和过 氧化物酶溶液的混合溶液中，通过静电作用，使过氧化物酶沉积吸附在载体表 面，吸附20min～60min后，用缓冲液冲洗2min～20min；

e.重复d步骤至少一次，即得固定化过氧化物酶。

所述石蜡油含Span-80乳化剂，所述石蜡油含Span-80乳化剂的体积浓度为 0.5％。

所述戊二醛溶液的体积浓度为8％。

所述步骤e中，重复d步骤三次。

本发明的技术效果在于：本发明用层层自组装技术将过氧化物酶固定化到 纳米磁铁颗粒的表面，不仅具有固定酶量多，且酶活力保留量较大；本发明制 得的固定化过氧化物酶活性高，有很高的稳定性，可以回收循环利用，可以用 于含苯酚苯胺废水的无害化处理。

本发明具有两大优势：1、可以形成多层酶结构，达到较高酶上载量；2、 可在常温水溶液中进行，不形成共价键，可以保证蛋白质分子维持生物活性的 天然构象，从而最大程度的保留其催化活性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

本发明是一种固定化过氧化物酶的制备方法，包括以下步骤：