[发明专利]单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种食品安全技术领域的试剂盒及检测方法，具体是一种单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

李斯特菌是革兰氏阳性无芽孢杆菌，该属内共有7种菌(单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、绵羊李斯特菌(L.ivanovii)、墨氏李斯特菌(L.murrayi)、西尔李斯特菌(L.seeligeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)、威尔氏李斯特菌(L.welshimeri)、英诺克李斯特菌(L.innocua))，其中仅单核细胞增生李斯特菌对人有致病性，是一种人畜共患病的病原菌，中毒症状严重，除了常见的呕吐、腹泻等胃肠道表现外，还可以侵蚀人体中枢神经系统(主要表现为败血症、脑膜炎、流产等疾病)，对机体造成极大的伤害。人类李斯特菌病的大多数病例分为零散性发生，爆发性发生或二者兼而有之。其发病率虽不高，但致死率可高达20％～30％。孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷者是易感人群。它在自然界广泛分布，蔬菜、乳制品、海产品、肉类和禽类等食品中都已证实是李斯特菌的传播载体，它可在4℃的环境中生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。

近年发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(如Walker CG，Meier S，Mitchell MD等在《BMC Molecular Biology》(BMC分子生物学)2009年第10卷第100页发表的题为《Evaluationof real-time PCR endogenous control genes for analysis of gene expression in bovineendometrium》(实时荧光定量PCR法分析牛子宫内膜内源控制基因的表达)一文中所述的)和病原体的定性定量检测(如Zago M，Bonvini B，Carminati D等在《Systematic and AppliedMicrobiology》(系统与应用微生物学)2009第32卷第514～521页发表的题为《Detection andquantification of Enterococcus gilvus in cheese by real-time PCR》(荧光定量PCR法定性定量检测奶酪中的肠球菌)一文中所述的)等方面得到广泛应用。

经对现有技术的文献检索发现，陈慧燕等发表于《中国热带医学》2006年第6卷第770～772页的题为《食品中李斯特菌检测方法探讨及药敏结果分析》的文章。该技术通过对8类食品45件样品的检测，其采用的国标法以及改良方法需要制备培养基、计算菌落数量和鉴定菌落的生化特性等，耗时较长，操作繁琐；其采用的Mini VIDAS法检出率较低，检测灵敏度不高。因此该现有技术并不适合当前食品快速检测的需求。

目前常规鉴定单核细胞增生李斯特菌的方法以常规培养方法为主(可见标准GB/T4789.30-2003)，根据生化特性、致病力及协同溶血试验等进行鉴定，鉴定周期需要5～10天。免疫学方法较快，但单克隆抗体制备困难，易产生交叉反应，特异性差。常规PCR方法虽然具有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题，因此亟待开发精确、灵敏、快速、无污染的快速检测方法。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。本发明的试剂盒可用于单核细胞增生李斯特菌的定性和定量检测；本发明的试剂盒检测特异性高，检测灵敏度高，定量准确，检测速度快。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒，包括：荧光定量PCR反应液、荧光探针、热启动TaqDNA聚合酶、标准阳性模板和阴性质控标准品；

所述的荧光定量PCR反应液具体为：10×PCR buffer、Mg²⁺、dNTPs、正向引物、反向引物；其中正向引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示；

所述的荧光探针的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，其中，荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为ELIPCE；

所述的标准阳性模板为重组质粒的DNA，该重组质粒的质粒为pMD18-T，整合的基因的碱基序列如SEQ ID No.4所示；