[发明专利]甘蓝型油菜小孢子简化高效培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及油菜小孢子培养方法，尤其涉及甘蓝型油菜小孢子简化高效培养方法，属植物新品种培育新方法。

背景技术

甘蓝型油菜是我国主要油料作物，其遗传育种、基因组学研究、代谢组学研究、种质资源创新、细胞遗传学研究和分子遗传学研究十分活跃。油菜小孢子离体培养在上述领域有着十分广泛的应用。

Lichter于1982年利用甘蓝型油菜游离小孢子培养获得再生植株，随后各国学者对影响油菜小孢子培养及其成苗的诸多因素进行了广泛的研究，使得油菜小孢子培养技术更为简化、效率更高、便于操作。我国学者根据我国温室栽培条件不足、取材主要来自大田的实际情况，研究了大田油菜小孢子培养的制约因素及相关技术，形成了一套有别于国外的甘蓝型油菜小孢子培养技术体系。但是，尽管如此，甘蓝型油菜小孢子培养技术仍然繁琐，效率低下，存在进一步简化和提高效率的要求和余地。

目前甘蓝型油菜小孢子培养技术主要来自Lichter的方法，主要包括：初花期从主花序和上部一次分枝花序上摘取处于单核晚期的花蕾16个，用75％的酒精进行1min的表面消毒，再在0.1％的升汞中消毒10min。用无菌水洗涤3次，在含13％蔗糖的B₅液体培养基(含B₅大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，pH5.8)中研磨成匀浆，用40μm的尼龙网过滤，滤液经800r/min离心5min，除去上清液，重复3次。加8mL含16％蔗糖和50mg/L的秋水仙素的NLN液体培养基中，于32℃恒温培养箱中暗培养2天，使小孢子加倍。将加倍后的小孢子悬浮液经800r/min离心5min，除去上清液。再加8mL含16％蔗糖的NLN液体培养基，将上述小孢子悬浮液分装于10个直径9cm的一次性无菌培养皿中，添加NLN液体培养基将培养皿底部覆盖。密封后将培养皿置于32℃恒温培养箱中热激暗培养2天，然后移到25℃恒温培养箱中暗培养至有肉眼可见的胚状体出现，转至摇床继续培养(40r/min，25℃，黑暗)至胚状体长大。之后将胚状体转移到含2％蔗糖的B₅固体培养基(含B₅大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，0.8％琼脂，pH5.8)的培养瓶中，在2℃低温生长箱中春化处理10d，再在25℃、16h光照及弱光下光照培养，长大后移栽到大田。

从上述的小孢子培养过程可以看出，甘蓝型油菜小孢子培养过程繁琐、复杂、效率低、成本高。尤其是每次取样折断整个花序，使得每个单株只能取样一次，取样的群体要求较大。对于只有少数种子的材料难以进行小孢子培养，而且由于取样来自不同的单株，单株间基因型的差别影响利用小孢子培养获得的DH群体用来研究遗传规律。而且，为了加快研究进程，我国大部分科研、教学单位在夏季到青海加代进行小孢子培养，胚状体苗的长途无菌运输也成为制约油菜小孢子培养成败的一个因素。

针对上述油菜小孢子培养中存在的问题进行研究，简化培养过程、提高培养效率、降低培养成本是决定油菜小孢子培养能否推广普及的关键。

发明内容

针对目前甘蓝型油菜小孢子培养中存在的问题，本发明在取样时期、时间、方式、提取液、培养方法、加倍方法和长途无菌运输等技术方面分别行了改进，目的是大幅度提高甘蓝型油菜小孢子培养效率、简化培养方法和培养程序、降低培养成本。

为实现本发明目的，技术方案如下：

1、将取样时期由过去的初花期提前到现蕾期

目前油菜小孢子培养的取样时间通常在油菜初花后。由于油菜花期升温快、可供取样的适合培养时间短，往往造成小孢子的培养时间紧，后期田间大量试验任务与室内小孢子培养工作重叠。为了增加小孢子培养时间、缓解开花后期田间与室内工作的矛盾，我们改进了取样时期，将现在的初花后取样提前到现蕾以后，提前的时间大约9天左右。具体方法为：在青海省西宁市青海农科院试验田，在现蕾期、气温在20℃的上午或下午，选取31005(H155×Qva)每个单株上所有2.8mm～3.5mm单核靠边期的花蕾40个，放入装有碎冰的50mL离心管中，置于冰盒中带回实验室。去掉碎冰，将30mL 84消毒液倒入50mL离心管中，盖上盖子，灭菌10min，其间反复上下摇晃，使84消毒液与花蕾和管壁充分接触灭菌。在超净工作台内将灭过菌的花蕾移入另外一个无菌的50mL离心管中，用4℃无菌水洗涤3次。然后按照小孢子培养程序进行小孢子培养。

表1取样时期对小孢子培养效果的影响