[发明专利]一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于油菜育种和分子生物学领域，更具体地涉及一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记，同时还涉及一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记的制备方法，还涉及一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记在提高油菜耐湿抗性育种中的应用。

背景技术

油菜是我国最重要的冬季油料作物，而长江流域又是我国最大的油菜产区，占全国油菜面积的80％以上。然而，长江流域普遍采用水稻-油菜轮作制度，加上秋季和春季气候湿润多雨，造成水稻田地下水位较高，油菜湿害严重，常年发生面积一般达到144.4万公顷，占总面积20％以上，可造成17.0～42.4％的产量损失，严重时甚至绝收。

油菜湿害研究主要集中在生理生化方面。湿害可造成油菜根际缺氧，糖酵解、乙醇发酵和乳酸发酵产生的乙醇、乳酸、氧自由基等有害物质对细胞形成伤害，使光合作用大大下降，甚至完全停止，分解大于合成，使生长受阻，产量下降，影响油菜株高、茎粗、根粗、根长、绿叶数、叶面积、干重，造成有效分枝数、单株角果数和粒数大幅下降。为减轻油菜湿害带来的产量损失，生产上一般采用开沟排水降低地下水位、土壤翻耕和中耕等农艺措施，但需要花费大量的劳动成本。为降低油菜生产成本，培育耐湿性强的油菜新品种是最为经济有效的途径。

有关油菜耐湿的遗传和育种研究较少，而且主要集中在油菜品种间的生理差异响应以及耐湿性遗传差异等方面(张学昆等，不同耐湿基因型甘蓝型油菜苗期对缺氧胁迫的生理差异响应，中国农业科学，2007，40(3)：485-491；张学昆等，甘蓝型油菜耐湿性的遗传差异鉴定，中国油料作物学报，2007，29(2)：204-208)。丛野等以生产中广泛种植的、耐湿性很强的优良品种中双9号(P₁)和湿害十分敏感的育种材料GH01(P₂)为亲本，配制了F₁、B₁、B₂、F_2:3等6个世代群体材料，分析了中双9号的耐湿抗性遗传规律，发现中双9号的耐湿抗性符合2对主基因+多基因混合遗传模型，主基因的遗传率为74～78％，耐湿性在早期选择效率较高(丛野等，甘蓝型油菜发芽种子耐湿性的主基因+多基因遗传分析，作物学报，2009，35(58)：1462-1467)。经文献查新，国内未见有关油菜耐湿抗性的分子标记及其应用的研究报道，也未见相关的专利技术公开或使用。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记，可利用分子标记技术开展耐湿抗性辅助育种，解决了常规育种方法中存在的湿害鉴定工作量大、周期长、易受环境影响等问题，提高了油菜耐湿抗性的遗传改良步伐。

本发明的另一个目的在于提供了一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记的制备方法，该方法简单易行，操作方便。

本发明还有一个目的在于提供了一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记在提高油菜耐湿抗性育种中的应用。通过耐湿抗性相关分子标记的早期鉴定和辅助选择，可显著提高油菜的耐湿抗性水平，极大减轻了耐湿性的鉴定工作量，有效提高了选择的效率和准确性。

本发明提供的一种油菜耐湿抗性相关的分子标记，其制备方法的步骤如下：

(1)以耐湿性强亲本中双9号(中国农业科学院油料作物研究所培育，种子市场可购买)和湿害敏感材料GH01(张学昆等，甘蓝型油菜耐湿性的遗传差异鉴定，中国油料作物学报，2007，29(2)：204-208)为研究材料，杂交得到F₁代，F₁代套袋自交得到F₂群体；

(2)用CTAB法(Doyle J.DNA protocols for plants-CTAB total DNAisolation.In：Hewitt G M，Johnston A.Molecular Techniques in Taxonomy.Berlin：Springer-Verlag，1991.P283-293)抽取油菜亲本及F₂群体单株叶片的DNA，采用简单重复序列标记(SSR)引物进行PCR扩增，扩增产物在6g/L变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，硝酸银染色后获得分子标记资料；

(3)采用苗期缺氧法(陈洁等，甘蓝型油菜耐湿种质资源的快速筛选，中国油料作物学报，2006，28(2)：138-143)测定每个F₂单株收获种子的苗期耐湿指数(相对活力指数)，耐湿指数小于0.30为湿害敏感；耐湿指数在0.30～0.70之间为中等耐湿，指数大于0.70为高耐湿；