[发明专利]一种茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的表达方法及其专用工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及涉及茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的表达方法及其专用工程菌。

背景技术

微生物谷氨酰胺转胺酶(Microbial Transglutaminase，MTG，E2.3.2.13)是一种催化多肽链中谷氨酰胺的γ-酰基转移至另一底物中的氨基，形成γ-谷氨酰化合物的转移酶。如底物为蛋白质，它能催化两个蛋白质之间的交联反应。底物包括乳清蛋白、麦胚蛋白、大豆蛋白、牛肌球蛋白和家禽类肌动球蛋白等(Zhu Y，Rinzema A，.TramperJ，Bol J.Microbal transglutaminase-a review of its production and applicationin food processing.Appl.Microbiol.Biotechnol，1995.44：277-282)。通过催化蛋白质或多肽之间的交联反应，可提高蛋白质的水溶性、起泡性、可搅拌性、热稳定性、乳化性等功能，从而使蛋白质类食品的质构、外观和风味等方面得到改善，并提高蛋白质的商业价值。目前，MTG已广泛应用于食品工业(Ye DY(叶丹英)，Peng ZY(彭志英)，Zhao MM(赵谋明)，Transglutaminase and its application in foodprocessing.Journal of Zhongzhou Grain College(郑州粮食学院学报)，2000.21(2)：46-49)。谷氨酰胺转移酶广泛存在于多种动物组织中，但由于含量低、分离困难、热稳定性差、对钙离子具有依赖性等因素，较难对其进行工业化生产。上世纪80年代末，Ando等发现茂原链轮丝菌、肉桂链轮丝菌和灰肉链轮丝菌等均能分泌MTG，且这些微生物所分泌的MTG具有热稳定性高、不需要钙离子，产物交联程度高等特点(Ando H，Adachi M，Umeda K，et al.Purification and characteristics of a noveltransgloutaminase derived from microorganism.Agric Biol.Chem，1989.53：2613-2617.)。虽然MTG现已可以进行工业化生产，但生产成本较高，限制了它的进一步应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的表达方法及其专用工程菌。

本发明所提供的表达茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的专用工程菌，是将含有茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的表达载体导入大肠杆菌中得到的；所述茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的GenBank号为AF531437。

用于构建所述含有茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的表达载体的出发载体可为pET-22b、pET-28或pET-15等，优选为pET-22b。

以pET-22b为出发载体，构建的含有茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的表达载体为pET-MTG。

所述大肠杆菌为适于蛋白表达的大肠杆菌菌株，优选为E.coli Rosetta(DE3)。

将含有茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶基因的表达载体转化大肠杆菌的方法可为生物工程领域中常用的转化方法，如热激法、电转化法、接合转化法、PEG介导的原生质体转化法等。

本发明的第二个目的是提供一种茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的表达方法。

本发明所提供的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的表达方法，是发酵上述茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶的专用表达工程菌，表达的茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶以包涵体的形式存在于菌体细胞中，收集包涵体，对其进行纯化、变性、复性和纯化后得到茂原链轮丝菌谷氨酰胺转胺酶。

发酵上述工程菌时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为0.8-1.2mmol/L，优选为1mmol/L，诱导温度为35-39℃，优选为37℃，诱导时间为2-4小时，优选为3小时。

对包涵体进行纯化包括以下步骤：将包涵体用含Triton的Tris-HCl缓冲液重悬。

对包涵体变性、复性可包括以下步骤：将包涵体在含8mol/L尿素，20mmol/L DTT和1mmol/L EDTA的Tris-HCl，pH6.5-9.0缓冲液中溶解后，迅速调节pH值至4.0，导致MTG复性。