[发明专利]检测血吸虫循环抗原的方法及其酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种血吸虫病的快速诊断方法，特别是一种检测血吸虫循环抗原的方法及其酶联免疫试剂盒。

背景技术

1、免疫诊断在日本血吸虫病防治中的重要性

血吸虫病是一种广泛流行于热带和亚热带地区的人兽共患寄生虫病，全球76个国家和地区的约2亿人口受感染，有6亿人口受感染威胁。我国是日本血吸虫病流行区，建国初期曾严重影响了人们的正常生产和生活。经过50多年的防治，已经取得了举世瞩目的成就，到2003年全国共有血吸虫病病人数843007人，较建国初期(1161.2万人)减少了92.74％。已有广东、上海、福建、广西、浙江等5省(区、市)阻断了血吸虫病的传播；仅剩湖南、湖北、江西、安徽、江苏等5省湖区及川、滇山区未得到控制。我们在欣喜的同时，也面临着进一步防治工作的巨大挑战。随着防治工作的深入，人群感染度不断下降，低度流行区扩大，血吸虫病的病原学诊断在现场大范围的应用越来越困难，不但敏感性差、费时费力，且不易被群众和工作人员接受。另一方面，现在控制血吸虫病的主要手段是吡喹酮化疗，但大规模、反复单一药物化疗，可能产生药物抗性，据国外报道，已经出现具吡喹酮抗性的曼氏血吸虫株，因此研制用于血吸虫病低度流行区的敏感性和特异性更高的诊断手段已经被列为第三大世界血吸虫病防治规划优先研究项目。

2、循环抗原在日本血吸虫病免疫诊断中的作用

经过几十年的发展，血吸虫病免疫诊断技术已具有较高的敏感性、特异性和可行性。检测血吸虫循环抗体是一种成本低、操作简单的检测，也是目前现场流行病学调查时应用最广的途径，但循环抗体在治疗后相当长一段时间内仍保持较高水平，不易区分既往感染和现症感染，无法在现场应用时确定目标化疗人群；而且难以反映药物疗效，不宜用作疗效考核的评价指标。另一种途径是检测循环抗原，循环抗原(circulating antigen，CAg)是存在于患者血液、唾液、尿液等体液中的血吸虫虫体的代谢产物及分泌物，检测患者血清或尿液中的循环抗原，可评估虫负荷数和活动性感染，可以作为诊断的依据。而且，在治疗后，CAg转阴较快，检测循环抗原可以作为疗效考核的依据，基于循环抗原检测的各种方法层出不穷，但都困扰在敏感性低、特异性不强的问题上，因此寻找敏感性高、特异性强的循环抗原检测方法和技术是血吸虫病免疫诊断的新方向。

3、IgY用作免疫诊断抗体的可行性

卵黄免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin，IgY)是鸟类、两栖和爬行类动物主要的免疫球蛋白。IgY是一种系统型抗体，可根据抗原分子的大小结合1～2个抗原，显示为单价或二价。IgY相对分子质量(Mr)为180000，沉降系数约为7.8，包含2个重链(H)和2个轻链(L)，重链相对分子质量(Mr)为68000，比IgG(H)(Mr50000)稍重。IgY的免疫学特性：(1)由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应。(2)不与类风湿因子(Rheumatoid factors，RF)结合。(3)不会激活补体系统。(4)不结合细菌和哺乳动物细胞表面Fc受体，使得IgY在双重免疫组化方面比IgG更具优势。(5)与IgG几无交叉反应，常用于循环复合物的测定.基于以上优点，IgY技术在医学领域已经得到广泛应用，特别是一些免疫诊断技术如沉淀反应、免疫电泳、ELISA、免疫电镜和免疫印迹，表明IgY完全可以取代传统的IgG。免疫十天后，在鸡体内即可获得高滴度的抗体，而且效价稳定，可以持续6-28周。另外，免疫鸡的饲养简单，花费少，符合3个RS[替代(replacing)、减少(reducing)、改善(refining)]的动物保护原则，减少了对动物的伤害。鉴于IgY的产量大、稳定性好、独特的免疫学特性以及动物种系发生学距离远等优点，被称为最有潜力的哺乳动物抗体替代品。

4.单克隆抗体技术在血吸虫病免疫诊断技术中的应用

自Kohler和Milstein(1975)发明单克隆抗体制备技术以来，单抗技术广泛运用于医学和生物学的各个领域，为疾病的发生、发展、诊断和治疗提供了重要的手段。单克隆抗体是由一个细胞产生的，其成分(类，亚类，型和结合P位等)是同源的，只针对复杂抗原的一个抗原决定簇，并有相同的亲和性，抗体滴度也很高，检测循环抗原具有高度的特异性，抗原和单抗可规模化生产，方法简便实用，且具有较好的疗效考核价值，可区分现症感染与既往感染，可用于血吸虫病的免疫诊断和流行病学现场调查。

发明内容：