[发明专利]转基因抗虫棉GK12的转化体特异性PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。特别是涉及一种鉴别转基因抗虫棉GK12的转化体特异性PCR 方法及其依赖的转化体特异性序列。

背景技术

我国是转基因作物的主要种植国家之一，2009年种植面积位于全球第六位。我国已经批 准商业化种植的转基因作物包括转基因抗虫棉花、抗木瓜环斑病毒的转基因番木瓜等。其中， 转Bt基因抗虫棉是我国种植面积最大的转基因作物，2009年种植面积达370万公顷，占我国棉 花种植总面积的近70％。我国目前广泛种植的转基因抗虫棉中，以Monsanto公司的MON531 转化体(如新棉33B等)和中国农业科学院生物技术研究所研制的国抗系列(如GK12等)为 两大重要的主栽品系。目前MON531的转化体特异性序列和转化体特异性检测方法已经有报 道，但国抗系列的代表品系之一GK12的转化体特异性序列和转化体特异性检测方法尚未见报 道。

目前，PCR技术是转基因作物检测中应用最为广泛的技术。在应用这种技术进行转基因 作物定性检测时，根据其扩增的靶标区域和特异性将其分为四类：一、筛选检测，以转基因 通用的外源启动子和终止子为靶标区域；二、基因特异性检测，以特异的外源目的基因为靶 标区域；三、构建特异性检测，以转基因元件之间的特异构建为靶标区域；四、转化体特异 性检测，以转化体特异性片段(外源插入片段与受体基因组连接区域)为靶标区域。这四类 检测方法对转基因作物的检测特异性是逐渐增加的，转化体特异性检测是目前对转基因品系 检测特异性最高的检测方法，也是目前转基因检测中最常用的身份检测方法，这种检测方法 能够区分同一转化载体产生的不同转化植株品系。

发明内容

针对上述领域中的空白，本发明提供了转基因抗虫棉GK12的转化体特异性序列以及鉴别 GK12的转化体特异性PCR方法，该PCR方法能利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出转 基因抗虫棉GK12，以及以GK12为亲本的棉花品系。

转基因抗虫棉GK12转化体特异性序列，如Seq ID No.1所示，其中转化载体序列位于1-546 bp，棉花基因组序列位于547-1625bp。

转基因棉GK12的转化体特异性PCR检测方法，其特征在于：PCR反应中的正向引物依 据SEQ ID NO1中1-546位序列设计，反向引物依据SEQ ID NO1的547-1625位序列设计。

根据权利要求1所述的PCR检测方法，

所述正向引物为GK12-F：5‘-CCGCAATGTGTTGTTAAGT-3’，

所述反向引物为GK12-R：5‘-TTCCCACATGGCCAAAAG-3’。

本发明提供的转基因抗虫棉GK12的转化体特异性序列以及依赖其建立的转化体特异性 PCR方法可作为一种鉴定转基因抗虫棉品系GK12，以及以这个品种为亲本的转基因棉品系的 有效手段，由于转基因抗虫棉GK12是我国目前广泛种植的转基因抗虫棉品系之一，因此本发 明为特异性鉴定转基因抗虫棉GK12提供了便利，该方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性 好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。

附图说明

图1转基因抗虫棉GK12转化体特异性序列的Genome Walking扩增

A：第一次Walking结果；B：第二次Walking结果

M：DNA Marker DL2000；1-8：DL1-DL8的Walking产物

图2转基因棉GK12转化体特异性PCR检测结果

M：DNA Marker DL2000；1：GK12，2-11：10个市场棉花样品

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制 本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述 的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。

实施例1

转基因抗虫棉GK12转化体特异性序列的克隆

1实验材料

1.1植物材料

转基因抗虫棉：GK12，本实验室有保存，可向公众发放。

1.2酶与试剂