[发明专利]鉴定转基因玉米中植酸酶基因表达框构建的PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因植物检测领域，特别是涉及鉴定转基因玉米中植酸酶基因表达框构建 的PCR方法。

背景技术

自从1996年转基因作物大规模商业化种植以来，全球转基因作物的种植面积迅猛增加。 2009年全球种植转基因作物种植的国家达到25个，种植面积总计达1.34亿公顷，是1996年 种植面积的79倍。其中转基因玉米全球种植面积达4100万公顷，占玉米种植面积的26％ (James，Clive.2009.Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops：2009.ISAAA Brief No.41.ISAAA：Ithaca，NY.)。

我国于2009年8月批准了转植酸酶基因玉米的生物安全证书 (http://www.stee.agri.gov.cn/biosafety/spxx/P020091127591594596689.pdf)，同时我国还批准国 外9个转基因玉米品种进口用作加工原料 (http://www.stee.agri.gov.cn/biosafety/spxx/t20091022_819214.htm)。获得生物安全证书的转植 酸酶基因玉米是由我国自主研发的，将黑曲霉中的植酸酶基因通过基因枪的方法转入到玉米 中，经过多代筛选培育而成的(Rumei Chen，Guangxing Xue，et al.Transgenic maize plants expressing a fungal phytase gene.Transgenic Res.2008，17：633-643.)。转入植酸酶可以降解玉米 中大量含有的植酸磷，释放可被动物利用的无机磷，减少饲料中磷酸氢钙的添加量，降低饲 养成本，减少动物粪、尿中磷的排泄，减轻环境污染，具有很广阔的应用前景。

目前我国已经研究和制定了多个转基因玉米的检测方法，并颁布为国家标准(如农业部 869号公告-3-2007转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt11及其衍生品种定 性PCR方法)，但转植酸酶基因玉米的特异性检测方法尚未见报道。尽管Chen等(Rumei Chen， Guangxing Xue，et al.Transgenic maize plants expressing a fungal phytase gene.Transgenic Res. 2008，17：633-643.)报道了转植酸酶基因玉米采用的启动子、终止子和目的基因的名称，但并 没有提供确切的可以直接查询到的序列信息，也未提供启动子、目的基因基因和终止子之间 的具体连接方式。对转基因检测来说，这些详细的信息对转基因材料的身份确认是必不可少 的。

PCR技术是转基因作物检测中应用最为广泛的技术。在应用这种技术进行转基因作物定 性检测时，根据其扩增的靶标区域和特异性将其分为四类：一、筛选检测，以转基因通用的 外源启动子和终止子为靶标区域；二、基因特异性检测，以特异的外源目的基因为靶标区域； 三、构建特异性检测，以转基因元件之间的特异构建为靶标区域；四、转化事件特异性检测， 以转化事件特异性片段(外源插入片段与受体基因组连接区域)为靶标区域。这四类检测方 法对转基因作物的品系检测特异性是逐渐增加的。构建特异性检测的特异性比筛选检测和基 因特异性检测高，可以区分相同基因与不同启动子和终止子构建方式，可以作为同一载体转 化的不同转基因品系的通用检测方法。

发明内容

针对上述领域中的空白，通过从转植酸酶基因玉米中分离获得的植酸酶基因表达框序列， 提出了鉴定植酸酶基因表达框构建的PCR方法，该PCR方法能利用普通的PCR仪器、试剂快 速准确鉴别出转特定植酸酶基因表达框的转基因玉米品系。

鉴定转基因玉米中植酸酶基因表达框构建的PCR方法，其步骤如下：

(1)采用引物对A/B和C/D分别对待测品种的基因组进行PCR扩增；

(2)凝胶电泳检测两对引物的PCR扩增产物，都出现目标长度的检测带的品种为转有Seq ID No.1所示核苷酸序列的构建载体的转基因品种，

引物对A/B的正向引物A根据Seq ID No.1所示核苷酸序列1-649bp位置设计，反向引物B 根据Seq ID No.1所示核苷酸序列650-2134bp位置设计；