[发明专利]一种用于结核病预防的重组卡介苗

说明书

技术领域：

本发明涉及基因工程领域和新型结核疫苗领域，具体涉及一种重组的卡介苗。

背景技术：

结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌引起的一种传染病，近年来随着流动人口增 加、人类免疫缺陷病毒(HIV)与结核杆菌伴发感染以及结核杆菌多重耐药性菌株的出现，使全 球结核病疫情增高，给全球结核病的防治提出了新的挑战。卡介苗(Bacille Calmette Guerin，BCG)是目前唯一用于预防结核病的疫苗，但是其免疫保护效果极不稳定，不同地区的 人群接种BCG后其免疫保护作用差异很大(保护率为0-80％不等)。开发比BCG更为有效的抗 结核病疫苗已成为当今迫切需要解决的问题。但目前尚没有任何一种新型疫苗能完全替代BCG 免疫，因此对卡介苗进行分子改造，研制更为安全有效的新型抗结核病疫苗具有特别重要的意 义。

BCG作为一种活疫苗，应用于免疫力低下的人群(如HIV感染者或艾滋病患者等)有较大的 局限性，将外源性基因导入卡介苗构建重组卡介苗(rBCG)是TB疫苗改造的重要方向之一。通 过BCG的生长繁殖，在体内表达分枝杆菌保护性抗原，从而更有效地激发机体免疫应答，增强 BCG的免疫效果。Horwitz在BCG菌株中引入编码MTB 30kD主要分泌型和细胞外蛋白(Ag85B) 的质粒来观察rBCG的效力，发现rBCG均能稳定表达这种蛋白分子，与亲本BCG免疫的豚鼠相 比，rBCG免疫的豚鼠尽管体重变化不明显，但动物存活率和组织抑制细菌生长的能力均超过 BCG，已计划开始进行I期人体试验。Bao构建了两株分别表达Hsp60-ESAT6融合蛋白和ESAT6 分泌蛋白的rBCG，前者比BCG诱导更高滴度的特异性抗体和更强烈的细胞免疫应答，而后者的 免疫原性与亲本BCG株相似，两株rBCG的毒力未见增强，都能明显抵御MTB感染，但免疫保护 效力方面尚低于BCG。目前，结核疫苗的研究主要集中在以下几个方面：(1)营养缺陷型结核减 毒活疫苗；(2)亚单位疫苗；(3)DNA疫苗；(4)重组卡介苗。尽管前三种方法都能不同程度的刺 激机体的保护性免疫反应，但其安全性也受到质疑。

在结核分枝杆菌中，早期分泌抗原靶6(earlier secreted antigenic taget 6，ESAT-6) 是一种分泌性抗原，和培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)是结核病免 疫诊断中2个很有前途的抗原。这2个抗原均由RD(Regions of deletion，RD)1区的RV3875 和RV3874基因编码，该区只存在于结核分枝杆菌复合群和少数致病性分枝杆菌基因组中，所 有BCG菌株基因组中均缺乏该区域，是BCG减毒传代过程中最先缺失的一段区域，与结核分枝 杆菌毒力和抗原性相关，能被宿主免疫系统高度识别，该区基因编码所表达的蛋白多属于免疫 优势抗原，可望成为新疫苗研制的主要候选分子。

ESAT-6可致再感染结核菌小鼠的记忆性免疫CD₄⁺T细胞增殖及早期IFN-γ的大量产生， 从而显著活化巨噬细胞，提高巨噬细胞对胞内结核菌的生长抑制作用和杀伤能力，同时在保护 性细胞免疫反应中也发挥着作用，并介导长期持久的免疫记忆。表达ESAT-6的重组BCG疫苗 优于亚单位疫苗和DNA疫苗，它既保留了BCG中的原有抗原，又增添了新的保护性抗原，且这种 抗原可被广泛识别，能强烈诱导宿主T淋巴细胞增殖和持久的免疫记忆。CFP10也是一种有效 的T细胞抗原，能够引发PPD阳性试验者的外周血单核细胞的增殖反应和IFN-γ的产生。单 一抗原的抗结核免疫效果不理想，而编码CFP10的基因RV3874的3′端位于ESAT-6基因 RV3875上游34bp处，2个基因方向一致，协同表达，共用1个启动子，CFP10和ESAT6形成1∶1 紧密的异二聚体结构，CFP10-ESAT6融合蛋白基因疫苗能诱导较强的细胞免疫应答，表明表达 CFP10-ESAT6融合蛋白的疫苗免疫效果较好，这种疫苗可能具有更好的免疫原性和保护力。