[发明专利]一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋经济蟹类青蟹属的物种鉴定领域，特别涉及一种快速鉴定青蟹属4种 青蟹的PCR方法。

背景技术

青蟹属(Scylla)属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、 梭子蟹科(Portunidae)，包括4个种：拟穴青蟹(Scylla paramamosain)、锯缘青蟹(Scylla serrata)、榄绿青蟹(Scylla olivacea)及紫螯青蟹(Scylla tranquebarica)，主要分布于太平洋、 印度洋的热带、亚热带和温带沿岸。在我国主要分布于东南沿海各省，以福建、广东和海 南最多，是我国重要的养殖蟹类之一。为了鉴定和保护在我国广泛分布的青蟹资源，马凌 波等(2006)利用线粒体COI基因序列对分布于我国东南沿海的青蟹的系统发生关系进行了 研究，结果表明广泛分布于我国东南沿海的青蟹绝大多数为拟穴青蟹，而不是先前认为的 锯缘青蟹。该研究结果同样被高天翔等(2007)和林琪等(2007)的研究所证实。

青蟹人工养殖及选择育种的重要前提是种质问题，即要搞清楚养殖对象的来源。到目 前为止，对青蟹的研究主要集中在养殖生物学及繁殖生物学等方面。对遗传学方面的研究 较少，主要集中在核外线粒体基因方面。林琪等(2007)对4种青蟹的表型特征进行了仔细 对比研究，发现可以从头胸甲额缘4齿的长度、形状来区分。但这种方法只适用于对4种 青蟹表型特征非常了解的专业人士，而对于不是专门搞青蟹分类研究的人员来讲，并不容 易掌握。此外，Klinbunga等(2000)报道了能够鉴别3种青蟹的RAPD分子标记，但由于 RAPD标记本身的不稳定性，导致该标记的重复性较差，故其鉴定的准确性并不高。因此， 迫切需要一种能够快速、准确鉴定青蟹属4种青蟹的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法，该方法 可快速、准确的鉴定青蟹属4种青蟹，具有操作简单，快速、准确、灵敏等优点，大大提 高了鉴定工作的效率和准确性。本发明主要应用于青蟹种质资源保护、管理及遗传育种等 领域。

本发明的一种快速鉴定青蟹属4种青蟹的PCR方法，包括：

(1)4种青蟹的基因组DNA的提取；

(2)线粒体COI基因序列分析及物种特异的引物设计

a.COI序列的获得及比对分析；

从公共数据库GenBank中下载四种青蟹的COI序列，利用DNAMAN 4.0生物学软件 进行比对，并保留这4种青蟹共有的359个核苷酸序列，进一步查找物种特异的核苷酸位 点；

b.物种特异的引物设计；

首先设计一对简并引物(Sc-F和Sc-R)，该引物能够在4种青蟹中扩增到相同片段长度 的产物；然后，以物种特异的核苷酸位点作为引物的3’端分别设计3条物种特异的引物 ScPa-R(拟穴青蟹)、ScSe-R(锯缘青蟹)、ScOl-R(榄绿青蟹)，这3条引物分别与简并引物Sc-F 配对，可扩增出物种特异的PCR产物；

这些引物的序列及相应的产物大小分别为：

阳性对照的引物(简并引物)序列为：

上游引物：Sc-F：5’-gayacdcgagcytaytttacatc-3’

下游引物：Sc-R：5’-taggattwagrgayaaacckgtaaa-3’

产物大小：325bp；

拟穴青蟹特异的下游引物序列为：

ScPa-R：5’-aacatagtggaaatgggctatg-3’

产物大小：243bp；

gacacacgagcctattttacatcagcaacaataatcattgctgttccaacaggaatcaaaatttttagatgactaagaactcttcatggtacaca aattaattataggccttcaatattatgagctttaggatttatcttcttatttactgttgggggtcttacaggagttgttttagctaattcatcaattgaca ttattctccacgatacatactatgtcatagcccatttccactatgtt；

锯缘青蟹特异的下游引物序列为：

ScSe-R：5’-aataaatcctaaagcccataataca-3’