[发明专利]一种用于人工肝透析的体外生物材料及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及透析用生物材料，具体涉及一种用于人工肝透析的具有代谢解毒功能的体外生物材料及其制备方法。

背景技术

生物性人工肝透析是维持和改善情况危急的肝功能衰竭患者生命的有效治疗方法。通常，生物性人工肝透析由如下两大部分组成：(1)透析的机械系统，其包括泵、半透膜支撑系统；(2)生物性系统，生物性系统主要分为细胞型代谢解毒和亚细胞型代谢解毒的生物材料。目前生物性人工肝的机械系统在技术上已经获得成功，也已经用于市场；生物性系统中的细胞型代谢解毒的生物材料面临的挑战是细胞的分离纯化的经济成本很大，细胞在肝透析系统中的支撑技术难度很高，限制了细胞型生物性人工肝透析的临床应用。然而细胞组分型代谢解毒的生物材料面临的挑战是参与代谢解毒的辅酶在制备过程中基本损失，辅酶的制备的经济成本很大，限制了亚细胞型生物性人工肝透析的临床应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种人工肝透析用的体外生物材料，具体涉及一种新的用于人工肝透析的具有代谢解毒功能的体外生物材料，尤其是一种新的猪肝亚细胞组分生物材料及其制备方法。

本发明的一种新的人工肝透析用的体外生物材料，其特征在于，其含有猪肝细胞组分，尤其是猪肝亚细胞组分。

本发明提供的新的猪肝亚细胞生物材料既含有肝的代谢解毒酶，又含有代谢解毒所必须的辅酶、能应用于人工肝透析。

本发明所述的人工肝透析用的体外生物材料通过下述方法和步骤制备：

1，试剂准备：

2、制备体外生物材料

1)组织准备

雄性约克夏种白猪肝，-80℃冷藏保存，其中每克肝组织准备3.0至3.5毫升的预冷的缓冲溶液A，在每毫升缓冲液A中加入20mM BHT，冰袋中保存；

2)匀浆

采用匀质机10000rpm下开始匀浆，去掉组织中的脂肪层及黏稠物，转速降至9200rpm下时停止；组织匀浆置于冰上保存；

3)离心

转移匀浆液至高速离心试管中，盖盖，于9000g下离心25分钟

离心完成后取出试管，置于冰袋中，上清液(S9)，经双层纱布过滤，缓冲液A及BHT的混合液稀释S9至20mg/ml，分装至2ml冷冻管中，编号，-70℃.下保存

本发明中，猪肝亚细胞组分生物材料其中的猪细胞组分采用雄性约克夏种白猪肝分离制备，蛋白浓度调整到40毫克/毫升。

3、药物代谢酶和代谢解毒检测效果检测

对该体外肝制品的药物代谢酶进行非那西丁O-脱乙基化、香豆素的7-羟基化和睾酮的6-羟基化等特征化研究。用胆红素与细胞色素P450辅酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶辅酶和该产品于37℃共同孵育60分钟，同时以0℃孵育为阴性对照。胆红素的葡醛酸化用-葡萄糖苷酸酶水解加以证实。胆红素解毒实验所用人血浆通过受试者知情同意。样品中胆红素的浓度用已被开发并被验证的HPLC方法检测。实验中以孵育后胆红素母体的消失表示该制品的解毒能力。

结果显示，

1、所述的的猪亚细胞型代谢解毒的生物材料其代谢动力学结果表明非那西丁O-脱乙基化的活性的Km为85uM、香豆素的7-羟基化活性的Km为17uM，睾酮6-羟基化的活性的Km为117um(如表1所示)。

表1猪肝细胞成分的细胞色素P450亚酶活性。

Table 1：Activities of CYP450s of the porcine liver preparation

2、代谢解毒结果：用胆红素与细胞色素P450辅酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶辅酶和本发明的猪肝亚细胞组分于37℃共同孵育60分钟，同时以0℃孵育为阴性对照。胆红素的葡醛酸化用-葡萄糖苷酸酶水解加以证实。胆红素解毒实验所用人血浆通过受试者知情同意。样品中胆红素的浓度用已被开发并被验证的HPLC方法检测。实验中以孵育后胆红素母体的消失表示该制品的解毒能力。以不含人血浆的缓冲液配制的20，40，100和200uM的胆红素与该制品孵育后分别代谢14％，31％，46％，和45％。以人血浆配制400uM的胆红素与该系统孵育后25％的母体被代谢。结果显示，大部分胆红素葡糖苷酸化的产物能够被β-葡糖苷酸酶水解(图2)。

实验证实，本发明提供的新的含有猪肝细胞组分，尤其是猪肝亚细胞组分的人工肝透析用的体外生物材料，能够代谢45％的胆红素，具有应用于人工肝透析的作用，可用于替代人工肝透析治疗中的生物系统。