[发明专利]东方百合种质资源离体保存方法

权利要求书

1.东方百合种质资源离体保存方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)培养基的配制：包括基本培养基和离体保存各阶段培养基的组分与各组分在每升培养基内所含重量为：

a)基本培养基：其中，

诱导培养基为蔗糖30～50g/L，琼脂粉4～5g/L，pH5.6～5.8的MS培养基；

增殖培养基为蔗糖50～60g/L，琼脂粉4～5g/L，pH5.6～5.8的3/5MS培养基；

离体保存与试管鳞茎膨大同步培养基为蔗糖60～75g/L，琼脂粉4.0～5.0g/L，pH5.6～6.0的1/2MS培养基；

b)诱导培养基I：MS+6-BA 1.0～2.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+AC1.0～3.0mg/L；

c)诱导培养基II：MS+6-BA 0.5～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；

d)增殖培养基：3/5MS+6-BA0.2～1.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L；

e)离体保存与试管鳞茎膨大同步培养基：1/2MS+NAA 0.1～0.5mg/L+PP333 1～10mg/L+甘露醇1.0～5.0g/L+AC 1.0～5.0mg/L；

(2)种源鳞茎处理与灭菌：将种源鳞茎以5℃低温处理3～4个月打破其休眠；再用透气塑料薄膜包裹该鳞茎置于含水量为60～70％的潮湿泥炭中，置50℃培养箱内热处理70～90min；剥离外层鳞片，取其内4～6cm长的种源鳞茎芽，用1％洗洁精液浸泡10min，经清水冲洗后进行种源鳞茎芽灭菌处理后，备用；

(3)鳞茎芽的诱导培养：取灭菌后种源鳞茎芽剥取其内0.2～0.3mm的茎尖作为外植体，接种于诱导培养基I，在温度20±1℃，光照12h/d，光照强度1000～3000Lx的环境条件下培养50～60d至诱导出鳞茎芽；将该鳞茎芽切去顶部叶片并纵向切成2块后转接至诱导培养基I，在同上环境条件下培养60～90d至诱导形成丛生状鳞茎芽；放入光照培养箱内按30℃、35℃、38℃的顺序，每3d变换一档进行循环热处理50～60d后，剥取其内0.2～0.3mm的茎尖为外植体接种于诱导培养基II进行二次诱导培养，在同上环境条件下培养60～90d至诱导形成鳞茎芽后，置6℃低温处理45～60d，以恢复该鳞茎芽的生长活性；

(4)鳞茎芽的增殖培养：将低温处理后的鳞茎芽，切去叶片和部分基部组织后纵切成4～6块接种在增殖培养基上，在20±1℃、黑暗条件下培养60～90d至形成健壮的鳞茎芽；

(5)种质离体保存与试管鳞茎膨大同步培养：将步骤(4)鳞茎芽切去芽顶部和部分基部组织并纵向切成4～6块后接种在离体保存与试管鳞茎膨大同步培养基中，在20±2℃和黑暗条件下培养12-15个月至切块基部形成的鳞茎芽膨大成直径为0.8～1.2cm的试管鳞茎；即可出苗或切除该试管鳞茎根系并纵向切成4～6块后接种在离体保存与试管鳞茎膨大同步培养基中，在相同条件下可循环再进行1-4次的保存与试管鳞茎膨大同步培养；4次后则需经田间种植恢复后再按上述步骤进行离体再保存，直至满足对该种质离体保存期的需要；

(6)试管鳞茎的出苗与冷藏：将试管鳞茎用清水洗去琼脂、包裹于消毒过的含水量为60～70％的泥炭中，10～12℃预处理10～20d后，于3～6℃冷藏处理50～60d至打破休眠期后，即定植或在1～3℃条件下2～3个月的延长贮藏期内择时定植；

(7)定植：选择海拔1000～1900米具夏季冷凉气候的山区，在避雨和防虫隔离条件下，将步骤(6)冷藏后的鳞茎于4月下旬至5月中旬定植在消毒过的基质里，15～20d后始萌芽出苗、生长；

(8)种质遗传稳定性的检测：选择生长正常，长势旺盛，经ISSR分子标记检测为未发生遗传变异的植株，培育成合格的东方百合种球。 

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的种源鳞茎芽灭菌处理为75％酒精浸泡0.5～1.0min，无菌水冲洗6次，再用0.1％升汞溶液灭菌15～20min，无菌水冲洗6次，再用10％的次氯酸钠水溶液灭菌13～15min，无菌水冲洗6次。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的定植基质为泥炭∶珍珠岩按体积比7∶3配制而成。