[发明专利]一种靶向肿瘤的双基因重组腺相关病毒载体

说明书

技术领域

本发明涉及病毒学、免疫学、基因蛋白质学、生物医药学领域，特别涉及含有双基因的重组腺相关病毒载体、其制备方法及其用途。

背景技术

恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一。目前临床上主要是采用放射治疗及化学疗法。然而，有些恶性肿瘤对放射治疗不敏感，对化疗易产生耐药性，因此寻找新的有效治疗肿瘤的候选药物和治疗方法是临床医生与患者的急切愿望。肿瘤分子生物学的研究表明，肿瘤细胞凋亡是肿瘤发生发展的关键环节。因而以诱导肿瘤细胞凋亡从而达到抑制肿瘤目的的策略成为近些年肿瘤基因治疗的热点。Caspase-3是细胞凋亡中重要的诱导和下游执行的中心分子。正常情况下，它在细胞中以酶原形式存在，一旦活化后即可以高效地不可逆地诱导细胞凋亡，且在多种肿瘤细胞的凋亡过程中广泛性存在作用。已有研究表明，将caspase-3的大小亚基颠倒可以得到具有天然活性的caspase分子(rev-Caspase-3)，这种重组活化的Caspase-3分子作用于肿瘤细胞后无需其它因子激活即可有效地诱导细胞凋亡，Caspase-3的大小亚基反向连接小亚基在前大亚基在后活性更好(J BiolChem，1998；273：10107-11)。

此外，肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的生成，通过抑制肿瘤新生血管生成，也是治疗肿瘤的一种途径。在内源性血管生成抑制因子中，内皮抑素(Endostatin，ES)最引人注目，它对体外内皮细胞具有明显的增殖抑制活性。在体内，其可特异性地抑制内皮细胞增殖和新生血管形成，从而抑制肿瘤生长。但国内外均有文献报道ES需与化疗药物联用才有较好的效果(Clin Cancer Res，2004，10(1pt1)：33-42.；中国肺癌杂志，2005，8(4)：283-290.临床肿瘤学杂志，2007，12(10)：728-735.)。虽然Caspase-3和内皮抑素各自具有较好的肿瘤治疗效果，但是尚没有同时使用Caspase-3和内皮抑素来治疗恶性肿瘤的报道，也没有将二者导入相同载体进而提供基因治疗药物的报道，为此，发明人想通过基因工程手段将Caspase-3和内皮抑素的基因同时导入合适的载体中，提供一种双基因靶向治疗载体，在保证caspase分子活性的基础上，可同时使ES具有较好的效果，从而实现强效治疗的目的。

为了实现上述目的，申请人对何种载体可以作为合适的候选载体进行了分析，最后选择腺相关病毒(Adeno associated virus，AAV)进行了尝试。因为腺相关病毒是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的细小单链DNA病毒。迄今为止，尚未发现与AAV相关的疾病报道，因此AAV被公认为是最安全的病毒载体。但由于包装容量的限制，其多用于单基因的构建、包装(Curr Opin Mol Ther.2003；5(4)：367-75.)。对于用AAV携带该双基因能否成功构建与有效表达尚不得而知。为此，申请人进行了本发明的研究工作。

发明内容

本发明首先将Caspase-3与内皮抑素双基因克隆构建于同一AAV载体上，经包装纯化后获得新型重组腺相关病毒载体。并通过细胞和动物实验验证新型重组腺相关病毒载体在体内/体外的抗癌效果，由此完成了本发明。

本发明的一方面提供了一种新的携带双基因在体内表达的、生物安全性高的重组腺相关病毒载体：rAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin。

该载体包含大小亚基反向连接的Caspase3和内皮抑素基因，其基因连接顺序为Caspase3小亚基-Caspase3大亚基-IRES-内皮抑素基因。也就是在腺相关病毒载体内可操作地连接有SEQ ID NO：9所示的序列。

本发明的另一方面是提供了制备如上所述的双基因重组腺相关病毒载体rAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin的方法，具体包括以下步骤：

(1)制备pAAV-Rev-Caspase3-IRES-Endostatin质粒

具体地，本申请的发明人采用RT-PCR方法，首先从人肺癌细胞株A549细胞中提取总RNA，通过逆转录获得cDNA，再根据设计的引物从该cDNA中分别扩增出caspase-3基因的543大亚基(LS：p17)及311小亚基(SS：p12)，然后通过预先设计的酶切位点按小亚基置前，大亚基置后的顺序连入pAAV-IRES-hrGFP多克隆位点，得到按照SS-LS的顺序连接的、含有活化的重组caspase-3基因的pAAV-Rev-Caspase3-IRES-hrGFP质粒。