[发明专利]一种敲除光滑球拟酵母线粒体基因的方法

权利要求书

1.一种敲除光滑球拟酵母线粒体基因的方法，其特征在于用带有目的基因的片段转化精氨酸缺陷型光滑球拟酵母，通过厌氧培养富集与筛选得到线粒体基因缺失的光滑球拟酵母。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因片段是指目的基因左边和右边分别为待敲除基因的左端和右端，目的基因片段的中间含有乙酰鸟氨化酸氨基转移酶基ARG8m。

3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述转化采用基因枪法，参数为载体为0.6um的金粉，距离为6cm，采用1100psi的破裂盘，真空度为29.5MPa。

4.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述光滑球拟酵母为感受态细胞。

5.权利要求1或2所述的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)根据乙酰鸟氨化酸氨基转移酶基因(ARG8m)及待突变基因序列设计扩增含有同源片段及ARG8m基因的引物，在5’和3’端分别引入BamHI(ggatcc)酶切位点，以携带ARG8m基因的载体为模板进行PCR扩增，得到含有待突变基因同源序列及AR G8m基因的片段，所述载体优选pDS24；

(2)PCR产物经BamHI酶切后与相同酶切的pUC19质粒连接，得到一个含有待突变基因敲除框的质粒；

(3)将所得质粒用基因枪转化光滑球拟酵母精氨酸缺陷型菌株；

(4)单个菌落经过亚克隆后，放入液体基本培养基中，用氮气排出空气，密封后于30℃培养24h，取培养物适当稀释涂布于基本培养基(MM)平板上；

(5)挑取单菌落分别影印至YPD和YPG平板上，在YPG平板上出现的而不在YPD平板上生长的，提取基因组进行PCR鉴定，即可得到线粒体基因敲除的光滑球拟酵母。

6.一种根据权利要求1所述方法得到的光滑球拟酵母，其特征在于所述的光滑球拟酵母含有乙酰鸟氨化酸氨基转移酶基因(ARG8m)，线粒体上目的基因被敲除。

7.权利要求6所述的光滑球拟酵母，其特征在于所述光滑球拟酵母ATP6基因被敲除。

8.权利要求6所述的光滑球拟酵母，其特征在于所述光滑球拟酵母ATP8基因被敲除。

9.权利要求6所述的光滑球拟酵母，其特征在于所述光滑球拟酵母ATP9基因被敲除。