[发明专利]编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物基因工程领域，特别是涉及一个草甘膦抗性编码基因的克隆与应用。

背景技术

在农业生产中，要定期除掉田间杂草以免它们跟农作物争夺肥料。与手工除草相比，喷洒除草剂可以减小劳动强度，降低劳动成本，提高粮食产量。除草剂有很多种，毒性有强有弱，针对性也不同。草甘膦是一种比较温和、对环境破坏性很低的除草剂，但是它在杀死杂草的同时，也对作物有破坏作用，影响作物的生长。农民为了能够有针对性地除去杂草，往往要用好几种毒性较强的除草剂。给农作物转入草甘膦抗性基因，让作物体内在这个基因的指导下生产出能抵抗草甘膦的破坏作用的某种酶，作物即使吸入了草甘膦也能继续生长。因此，种植了抗除草剂转基因作物后，农民只要施加一两次温和的草甘膦，就可除去野草，又不损害农作物，而不必采用多次施加各种较有针对性但是毒性较强的除草剂。

一直以来，从自然界中寻找对草甘膦具有良好抗性的基因是我们的研究重点。各国科学家已经从根癌农杆菌(A.tumefaciens sp.strainCP4)、无色杆菌(A.sp.strain LBAA)、假单胞菌(P.sp.strain PG2982)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)等菌株中克隆了对草甘膦不敏感的EPSPS基因。这些基因在农作物中的过量表达，可以提高植物对草甘膦类除草剂的抗性。此外，通过突变EPSPS的某些位点的氨基酸，可以降低EPSPS对草甘膦的亲和性，提高基因的草甘膦耐受性。

20世纪80年代以来，美国Monsanto和Calegene等公司获得转基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等作物系列品种，其中大豆等多种转基因作物已进入商品化生产。但大面积商业化应用的主要是Monsanto公司的CP4 EPSPS基因。目前，培育能够稳定遗传，并保证作物产量、质量的抗草甘膦作物仍是研究的重点。

发明内容

本发明的目的是提供一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，其具有优良的草甘膦抗性。

一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，其中所述EPSPS具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或该序列经改变、添加和/或缺失一个或多个核苷酸且具有相同功能的氨基酸序列。本发明的基因，其具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明的基因是从新疆纳拉提草原周边采集的土样中分离获得的一株人苍白杆菌中通过同源克隆的方法从该菌株中克隆得到的。通过草甘膦抗性实验，发现该基因具有良好的草甘膦抗性，可以耐受200mM草甘膦浓度，是同类基因中的优秀者。通过与经典的一型和二型合酶进行同源性比对发现，该基因与二型合酶相似性更高。通过进一步的分析发现，二型合酶中与草甘膦耐受有关的保守序列GDKS，SAQVK，NPTR，和RDHTE均在野生型的P23EPSPS中存在。通过将此基因连接到原核表达载体上并转入EPSPS合酶缺陷的大肠杆菌中发现，该基因可以互补EPSPS缺陷，使缺陷菌株恢复在M9限制性培养基上生长的功能。

应当理解，考虑到密码子的简并性和用于具体表达的植物或微生物的优选密码子，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响基因表达的条件下，对SEQ ID No.1所示的核苷酸序列进行修改。因此，本发明还包含对SEQ ID No.1所示序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与本发明基因相同功能的核苷酸序列。

进一步地，本发明提供所述基因的克隆载体或表达载体，以及其转化宿主。其宿主可以为原核细胞、植物细胞、植物组织等等，其中的原核转化宿主细胞，可耐受300mmol以下的草甘膦。

本发明还提供一种5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，其具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，并且，本发明还包括对表达自本发明基因的蛋白质(SEQ ID No.2)进行各种取代、添加和/或缺失一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明提供的基因和表达载体可用于转化农作物，达到植物耐受除草剂的目的。

附图说明

图1为实施例1中aroA_P23PCR扩增结果，其中1：DL2000Marker，2：aroA_P23；

图2为实施例4中aroA_P23互补实验结果，其中1：ER2799，2：ER-pUC18，3：ER-pUCP23；