[发明专利]一种大豆种子特异性启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及大豆天冬氨酸蛋白酶基因启动子的序列及其应 用。

背景技术

大豆是我国重要的经济作物，籽粒中含有丰富的蛋白质、脂类和多种营养元素，磷、铁、 钙矿质比其他作物高几十倍，并含有多种维生素，特别是大豆中含有人体不能合成的8种必需 氨基酸，是其他谷类作物不能比拟的。大豆不仅是人类蛋白和脂类的主要来源，医疗保健作用非 常明显。因此，以大豆种子作为生物反应器，利用植物基因工程方法，在转基因大豆种子中 产生具有工业用途及药用价值的大豆新品种已成为人们研究的热点。

在转基因大豆中增加或降低某些物质含量，实现外源目的基因在转基因大豆中正常、有 效表达，首要考虑的问题是选择适合的植物启动子。目前在植物表达载体中广泛应用的是组 成型启动子，在该类启动子的调控下，外源基因在转基因植物的所有部位和发育阶段都会表 达，造成植物营养不必要的浪费，有时还会影响到植物的正常生长发育。种子特异性启动子 能够调控外源基因在种子中特异性表达，使所表达的外源蛋白都集中在种子中，因此，种子 特异性启动子是大豆品质改良工程中必不可少的有利工具。目前，已克隆获得的种子特异性 启动子主要来自于粮食作物及油料作物种子中的蛋白、氨基酸、淀粉、脂类等合成代谢途径 中相关的酶基因的启动子。一些种子特异性启动子在应用中显现出了极显著的效果，如玉米 胚乳特异启动子驱动小麦基因在玉米中表达，降低了籽粒的硬度，有利于玉米的湿磨及家畜 饲喂；水稻中Ole18基因启动子驱动RINO1基因在种子中特异表达，降低了水稻籽粒中植酸 含量；napin基因启动子参与的自我剪切载体在油菜种子中特异表达，应用于建立无标记的 安全转基因植物等。

在大豆基因工程研究利用中，可以使用来自近缘的其他植物的种子特异性启动子，但是 有时种子特异性启动子在非本植物中表达时易出现非种子特异表达，如蚕豆USP基因启动子 可以驱动报告基因在转基因拟南芥种子中特异性表达，但该启动子驱动报告基因在转基因豌 豆的花药、花粉和种皮中都表达；有时种子特异表达的强度也可能会发生改变。如：棉花的 α-球蛋白启动子在转基因拟南芥和烟草中驱动GUS的表达活性只是棉花中16.7％和1％，说 明在大豆转基因研究中，利用大豆本身的种子特异性启动子是十分必要的。

大豆中已克隆的种子特异性启动子并在转基因研究中得到应用的主要有：伴大豆球蛋 白、球蛋白和油质蛋白的启动子，与其他粮食作物相比数量较少。可能是由于专利保护的原 因，一些大豆种子特异性启动子不能被利用；水稻的谷蛋白，醇溶蛋白、玉米醇溶蛋白启动 子是种子特异性启动子，但大豆不属于谷类作物，所以在大豆中不存在谷蛋白和醇溶蛋白这 两种蛋白基因的启动子；与淀粉合成有关的种子特异启动子有小麦的淀粉粒结合淀粉合成酶 和水稻的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的启动子，但大豆种子中碳的贮藏主要与三酰基甘油有关， 而不是淀粉，大豆中与淀粉合成有关的种子特异表达基因可能相对较少。因此，获得一种新 的大豆种子特异性启动子，对大豆新品种的研究开发及植物基因工程发展具有推动作用。

发明内容

本发明提供一种大豆种子特异性启动子，以解决目前缺少大豆种子特异性启动子的问题。

本发明采取的技术方案是：

一种大豆种子特异性启动子，其核苷酸序列如Sequence NO.1所述。

本发明所述的大豆种子特异性启动子的制备方法，包括下列步骤：

a.soyAP1基因上游远端序列的克隆：

利用TAIL-PCR方法，设计3个嵌套引物：

SP1：5’-GAAACGCGGTTAGGAAAACAGATGAG-3’

SP2：5’-GAGGAATAGGTTTACCGATACGTGGAGA-3’

SP3：5’-CAGTAGTGTCACACCTTCCTTCCTCTTT-3’

与随机兼并引物AD4：5’-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3’，进行三次PCR反应， 获得865bp的上游远端序列；

b、对soyAP1基因ATG上游序列进行分析，设计各缺失片段分别为SAP1，SAP2，soyAP1-p 和SAP4；

c.利用Y3：5’-GGGCTGCAGTTAAATTTATTGATGAAAGG-3’和