[发明专利]蛋白质氧化复性新方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及变性蛋白的复性技术，主要是氧化复性技术。

背景技术：

重组DNA技术使在细菌或其它宿主细胞中大量表达多肽和蛋白分子成为可能。重组表达的蛋白类产品已获得了许多成功。然而，异源宿主表达技术经常遇到蛋白产物在宿主细胞内沉淀的情况。沉淀的蛋白以包涵体形式存在，它们不具有天然的三维结构，处于变性状态，通常没有生物活性。

变性蛋白需要在体外进行处理，使其获得具有生物活性的空间结构。该过程称为复性或蛋白折叠(重折叠)。体外复性常常是多肽和蛋白类产品生产过程成功的关键因素。

Anfinsen理论认为，多肽分子的一级结构，即其序列是蛋白高级结构以及活性的决定因素[Anfinsen CB，Haber E，Sela M，et al.The kinetics of formation ofnative ribonuclease during oxidation of the reduced polypeptide chain.Proc NatlAcad Sci USA，1961，47：1309-1314]。该理论是现代蛋白质化学的重要理论基础。然而，近来更多的实验证据表明，一级结构本身并不足以确定蛋白产物精确的三级结构。已经知道，细胞合成蛋白分子的同时，有多种其他蛋白和酶参与和辅助了该蛋白分子的正确折叠，这些蛋白和酶包括伴侣分子、蛋白氧化还原酶以及一些蛋白异构酶等[Ruddon RW，Bedows E.Assisted protein folding.J BiolChem.1997；272：3125-3128]。

在蛋白复性和折叠过程中，会形成具有一定结构的部分折叠的分子形态，称为中间体。早期中间体可能与折叠过程中的蛋白聚集现象有关。部分折叠的中间体含有相邻的大片表面疏水区，使得这些中间体有很强的聚集倾向。中间体分子的特定疏水表面结构元素与相邻分子的配合疏水表面结构元素相互作用，导致其分子间聚集。最初的聚集物可能是二聚体或四聚体，为可溶性；当聚集体尺寸超过溶解性极限时，就形成沉淀[Fink AL.Protein aggregation：foldingaggregates，inclusion bodies and amyloid.Fold Design，1998，3：R9-R23]。一旦不溶性的聚集物形成，自然状态下，这一过程是不可逆的。

多种蛋白分子，特别是由细胞分泌的具有重要功能活性的蛋白分子，内部通常含有天然二硫键；二硫键对于这些蛋白分子的结构稳定性和活性，有重要作用[Betz SF.Disulfide bonds and the stability of globular proteins.Protein Sci.1993；2：1551-8]。在真核细胞中，蛋白分子合成后，借助二硫键氧化酶和二硫键异构酶的作用，数分钟甚至数秒内即可形成正确完整的二硫键连接。但在体外折叠复性时，二硫键的形成过程非常缓慢，并需要有合适的氧化性小分子和还原性小分子的适当配合，使错误配对的二硫键连接转换成正确二硫键，以促进复性。这些氧化性小分子和还原性小分子的配合，称为氧化还原对(redox)，如还原型/氧化型谷胱苷肽(GSH/GSSG)、还原型/氧化型二硫苏糖醇(DTT^red/DTT^ox)、半胱氨酸/胱氨酸(cysteine/cysteamine)等。该复性过程称为氧化复性或氧化折叠。