[发明专利]密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列及其核酸疫苗

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因片段及其核酸疫苗。

背景技术

艰难梭菌是一种革兰氏染色阳性、有芽胞、专性厌氧的梭状杆菌。当前，艰难梭菌感染的预防、诊断、治疗面临着重重困难。一方面，艰难梭菌广泛存在于院内环境中，而且作为其休眠形式的芽胞能够耐受多种院内常用的消毒剂，它已经成为仅次于弯曲杆菌的院内感染性腹泻的主要病原体；甲硝唑、万古霉素，作为治疗艰难梭菌感染的两种主要的药物，它们的耐药性也在不断地累积、传播，疗效日趋降低，而且对于复发病例的治疗，这两种药物呈现出无能状态。另外一方面，到目前为止，尚无有效的、商品化的疫苗问世；基于毒素的ELISA检测试剂盒价格昂贵，难以对艰难梭菌进行临床常规检测，也不适用于大规模的流行病学调查和长期监测；治疗性抗体作为一种安全、有效、廉价的抗生素替代品，前景光明却依然处于探索期。所以，急需开发安全、有效、方便、廉价的艰难梭菌疫苗来保护高危人群；同时，争取在疫苗的基础上开发相应的单克隆抗体，为诊断试剂及治疗性抗体打下扎实基础。

艰难梭菌通过粪口途径进入消化道，继而分泌外毒素而导致腹泻。其中，毒素A既是一种肠毒素，又是一种细胞毒素，是艰难梭菌致病的主要毒力因子。研究发现，艰难梭菌外毒素A只有当其羧基端与靶细胞表面受体结合后才能够发挥毒性作用；艰难梭菌外毒素A的分子表面结构大部分为其羧基端所覆盖；针对艰难梭菌外毒素A羧基端的抗体，能有效抑制其肠毒性和细胞毒性，具有保护效应。所以，艰难梭菌外毒素A羧基端是疫苗研究和抗体开发的理想结构域。

核酸疫苗(nucleic vaccine)，又名基因疫苗(gene vaccine)或DNA疫苗(DNAvaccine)，其本质是含有抗原基因的真核表达载体被导入动物机体后为动物细胞所摄取并表达相应的抗原蛋白，从而诱导机体对该蛋白的免疫反应。作为近几年来新兴的一种疫苗，它以其独特的优点吸引着人们：(1)抗原合成和递呈过程与病原体的自然感染相似，通过MHC I类和II类分子直接递呈免疫系统。特别是诱导产生特异性CD8+淋巴细胞(CTL)的免疫反应，这是灭活疫苗和亚单位疫苗所不能比拟的；(2)免疫原的单一性。只有载体上的抗原基因在细胞内得到表达，载体本身没有抗原性。而重组的病毒活载体疫苗除了目的基因表达外，还有其自身的许多蛋白得到表达；(3)易于构建和制备，稳定性好，成本低廉，适于大规模生产。但是目前用来构建核酸疫苗的目的基因绝大多数来自于病毒或细菌等原核生物，而疫苗的研究和应用对象主要为真核生物，如小鼠，猕猴或人类等高级哺乳动物。由于原核生物与真核生物在密码子使用偏好上存在差异，导致用来构建核酸疫苗的外源基因在哺乳动物宿主体内不能有效表达，因此就不能有效地刺激宿主的免疫系统产生较好的免疫保护作用。这是导致目前核酸疫苗免疫原性较低的主要原因。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列。

本发明的另一目的是提供一种由上述基因构建的艰难梭菌外毒素核酸疫苗。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列，序列为SEQ ID NO.1

一种艰难梭菌外毒素核酸疫苗，由序列为SEQ ID NO.1的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列和真核表达载体组成。

所述的真核表达载体为pJW4303。

本发明提供的密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列及其核酸疫苗的构建步骤如下：

(1)密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列的设计和合成

首先选取艰难梭菌外毒素A基因羧基端末尾978个碱基序列，然后运用软件MacVector 7.2分析编码的基因序列，找出其密码子使用偏好同时找出与哺乳动物密码子使用偏好、与大肠杆菌密码子使用偏好不同的密码子位点。对于哺乳动物和大肠杆菌使用偏好相同的密码子，用哺乳动物和大肠杆菌都偏好的密码子替代艰难梭菌外毒素A基因中使用偏好不同的密码子，然后设计出密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端序列，并经过基因公司的化学合成得到了密码子优化的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列。密码子优化的序列所编码的蛋白质氨基酸序列与原有的氨基酸序列保持一致。例如：艰难梭菌外毒素A基因中编码异亮氨酸Ile的三联体密码子主要是ATT，而在人类、小鼠等高级哺乳动物基因组中主要是ATC，在大肠杆菌中也主要是ATC，在密码子优化时会选用哺乳动物细胞和大肠杆菌都偏好的密码子ATC。优化后的艰难梭菌外毒素A羧基端基因序列为SEQ IDNO.1，优化前的序列为SEQ ID NO.2。