[发明专利]一种制备担子菌原生质体的试剂盒及其使用方法和应用

权利要求书

1.一种制备担子菌原生质体的试剂盒，其特征在于，含有担子菌裂解酶和等渗缓冲液R1或等渗缓冲液R2，所述的等渗缓冲液R1包括硫酸镁和磷酸缓冲液，所述的等渗缓冲液R2包括氯化钾和磷酸缓冲液。

2.根据权利要求1所述的制备担子菌原生质体的试剂盒，其特征在于，所述的硫酸镁和氯化钾的摩尔浓度为5.5～6.0mol/L。

3.根据权利要求2所述的制备担子菌原生质体的试剂盒，其特征在于，所述的磷酸缓冲液的PH为5.6～5.8，所述的磷酸缓冲液通过磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制获得。

4.权利要求1-3所述的试剂盒在制备侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄伞、云芝、蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳的原生质体中的应用。

5.权利要求1-3所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)按常规方法培养菌丝；

(2)取常规培养的菌丝，过滤，用无菌水冲洗，对侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄伞或云芝，用溶液R1洗涤，对蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳，用溶液R2洗涤，将洗涤后菌丝置于离心管中，室温下离心后，收集菌丝；

(3)对侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄伞或云芝，将担子菌裂解酶用溶液R1配制成溶液后过滤除菌，对蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳，将担子菌裂解酶用溶液R2配制成溶液后过滤除菌，收集滤液到无菌离心管中，并加入收集的菌丝；

(4)将离心管置于水浴中，间歇振摇进行水解反应；

(5)反应结束后，将反应液加入离心管中，离心后收集原生质体，对侧耳、黑木耳、毛木耳、近裸香菇、金针菇、光帽黄伞或云芝，用溶液R1定容，对蘑菇、香菇、鸡纵、灵芝或白木耳，用溶液R2定容；

(6)采用血球计数法计算原生质体的量，并冷藏保存备用。

6.根据权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(3)中配制的含担子菌裂解酶的R1或R2溶液的质量浓度为10～15mg/mL。

7.根据权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(3)中过滤除菌用的微孔滤膜的直径为0.22μm。

8.根据权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(3)中菌丝和含担子菌裂解酶的R1或R2溶液的料液比为90～110mg/ml。

9.根据权利要求5所述的担子菌原生质体的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(4)中水浴的温度为28～30℃，反应时间为1.5～2h。

10.根据权利要求5所述的担子菌原生质体的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(5)中离心管的转速为1000rpm，离心时间为10min。