[发明专利]一种检测鸭圆环病毒抗体的间接ELISA方法

说明书

(一)技术领域

本发明所涉及的是一种用于检测鸭圆环病毒抗体的间接ELISA方法，属于兽用生物制品的生产领域。

(二)背景技术

鸭圆环病毒(Duck circovirus，DuCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)的成员之一，是一类没有囊膜的单链环状DNA病毒，该病毒于2003年由Hattermann在德国首次报道以来，已分别在匈牙利、美国、中国台湾及中国大陆等地被发现或报道。鸭圆环病毒感染的鸭子所表现的临床症状主要表现为发育状况差，并且明显表现羽毛营养失调，在背部脊柱(的羽毛)尤其明显，许多羽毛羽轴出血，背部皮肤组织病理学检查主要表现为囊泡和围绕囊泡的组织异嗜性炎性渗出，内脏器官总的病理表现为鸭传染性浆膜炎协同感染的症状，对法氏囊组织病理学检查表明，淋巴细胞损伤、坏死、组织细胞增多(Hattermann et al.，2003)。作为一种新发现的病毒，DuCV自2003年以来，已在上述的四个国家相继报道。德国报道的Mulard duck群中DuCV的个体阳性率为46％(6/13)(Hattermann et al.，2003；Soike et al.，2004)，匈牙利Pekin duck群中(Fringuelliet al.，2005)报道的DuCV阳性率为84％(85/101)，在中国台湾地区Muscovy duck群中DuCV阳性率为38.2％(13/34)(Chen et al.，2006)。姜世金等报道在我国福建发生鸭传染性浆膜炎的43只病死鸭中的34只、12个鸭群中的10个鸭群为DuCV阳性(Jiang et al.，2008)。张兴晓等报道在所调查的山东省742只樱桃谷鸭中，DuCV感染率达到三分之一，然而，单纯感染DuCV的样品只占被调查样品总数的18.10％，15.19％为DuCV和其他病原的混合感染，其中，二重感染的比率为9.57％(RA.或E.coli)，三重感染的比率为4.85％(RA+DHV-I或E.coli)，四重感染的比率为0.81％(RA+DHV-I+E.coli)(Zhang et al.，2009)。刘少宁等进行的山东、江苏、四川、福建、广东五个省份36个鸭群临床有发病表现的343只病、死鸭的多个病理组织(肝脏、脾脏、法氏囊，胸腺和骨髓随机采样)DNA的PCR检测显示DuCV个体阳性率为81.63％，群体阳性率为94.44％。表明我国鸭群中DuCV感染的普遍性(刘少宁等，2009)。

由于没有可行的体外增殖培养DuCV的方法，目前尚不能在实验室完成病毒的分离鉴定。目前对DuCV的研究主要集中在PCR检测及全基因组序列测定分析两个方面。普通PCR和荧光定量PCR两种方法均已用于DuCV感染的诊断。二者均具有特异性好、灵敏度高的优点，但荧光定量PCR的灵敏度要比普通PCR高1个数量级，而普通PCR则具有简便适用、成本低廉的优点，更适合在生产中推广应用(Hattermann et al.，2003；Soike et al.，2004；Fringuelli et al.，2005；Chen et al.，2006；Jiang et al.，2008；刘少宁等，2009)。另外，核酸探针杂交检测的方法也在实验室中得到应用，这种方法既可以用于对提取的组织DNA进行检测，也可以对福尔马林固定石蜡包埋样本进行原位检测(Zhang et al.，2009；刘少宁等，2010；Fringuelli et al.，2005)，但在检测灵敏度方面，核酸探针杂交要远低于PCR检测，但其稳定性与可重复性均要高于PCR检测，并且可以根据显色情况对被检的目的核酸进行大致的定量。

血清学调查一直是进行疫病检测的有效手段，特别是适用于健康或者活的动物的检疫，其中，酶联免疫吸附实验(ELISA)由于其标准化、可高通量大量检测样本而成为目前应用最为广泛的一种血清学检测方法。由于目前DuCV不能在体外增殖培养，从病理组织中大量获取抗原也不可取，所以通过分子生物学方法大量表达DuCV的抗原蛋白并以此作为包被抗原建立检测鸭血清中抗DuCV抗体的ELISA方法成为对DuCV感染进行血清学调查的最佳选择。