[发明专利]小分子RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种小分子RNA的提取方法，具体地，本发明涉及无酚/氯仿抽提的小分子RNA的提取方法。

背景技术

由于小分子RNA可能参与分化、发育、组织生长、脂肪代谢等生理过程，在不同的组织和发育阶段的表达水平有所不同，进一步了解小分子RNA的生物功能具有重要意义。

微小RNA(microRNA，简称miRNA)是生物体内源长度约为20-23个核苷酸的非编码单链小分子RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。由于微小RNA存在的广泛性和多样性，提示微小RNA可能有非常广泛多样的生物功能。尽管对微小RNA的研究还处于初级阶段，据推测微小RNA在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要并可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式。对一部分微小RNA的研究分析提示：微小RNA参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡，脂肪代谢和细胞分化以及和癌症的发生发展密切相关。

可见，对小分子RNA的研究日益受到重视。然而，进行小分子RNA分析的第一个关键步骤就是从生物样本中纯化小分子RNAs。多数传统RNA分离试剂盒目的是为回收mRNA而设计的，往往会弃去较小的RNA分子以减少干扰提高mRNA得率。因此这些步骤会导致一些小分子RNAs，如微小RNAs的损失。另外，此类方法往往涉及酚/氯仿等有毒化学物质的抽提。多数RNA纯化试剂盒采用的标准玻璃纤维滤膜或者硅胶滤膜，不能有效的回收更小的小分子RNA，如微小RNA。例如，利用这些方法虽然能有效回收5.8S rRNA，但微小RNA部分或者全部被弃除。

随着对小分子RNA，尤其是微小RNA研究的逐渐深入，小分子RNA的分离技术逐渐成为一种需求。微小RNA的分子量相对较小，对于常规的核酸提取法都不适用。微小RNA只有在乙醇浓度很高的条件下(大于70％)才能与核酸提取柱相结合，从而得到分离。但在该浓度的乙醇条件下，绝大多数的其他分子，特别是大分子都会被沉淀，使分离无法进行。目前多采用利用毒性很强的酚以及氯仿等有机试剂，首先将大分子沉淀除掉，然后纯化总的核酸。除了使用的试剂有毒外，大分子的DNA和RNA仍然会影响对微小RNA的进一步分析。

因此，有必要开发新的小分子RNA的提取方法。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种小分子RNA的提取方法。

本发明的方法是通过以下技术方案来实现的。

本发明提供一种小分子RNA的提取方法，其不使用酚/氯仿处理样品，具体地，所述方法包括以下步骤：1)采用裂解液处理样品后，再用滤膜过滤样品，除去样品中的大分子组分，得到小分子组分；2)进一步纯化小分子组分，得到小分子RNA。

优选地，所述步骤1)中滤膜的截流分子量为20K到100K，优选为30K和50K。

优选地，所述步骤2)中小分子组分的纯化是通过以下方法来实现的：先采用有机溶剂处理小分子组分，再直接通过核酸结合柱纯化。

优选地，所述有机溶剂选自乙醇和异丙醇。

优选地，所述核酸结合柱选自RNA结合柱和DNA结合柱。

优选地，所述小分子RNA包括微小RNA、小干扰RNA和小核RNA。

优选地，所述样品为生物样品，选自细胞、组织提取物、血液、血清、血浆、唾液、精液、尿液、腹水、脑集液及泪液分泌物。

由此可见，本发明采用滤膜法，首先将样品中含量丰富的大分子组分如DNA和蛋白与分子量较小的小分子组分分开，微小RNA存在于小分子组分中。含有微小RNA的小分子组分经乙醇处理后，直接通过RNA的特异结合柱(RNA特异结合柱包括所有RNA结合柱)加以纯化，具体的提取过程如图1所示。本发明对于液态生物样品，例如组织，血清，血浆，唾液和尿液等更有其特点。可直接经样品裂解液作用将样品中的微小RNA与其结合的大分子蛋白或DNA分子分离，游离的微小RNA在高浓度的乙醇存在下可以与微小RNA的特异结合柱结合，并得以纯化。

更重要的是，本发明不涉及有毒的化学成分，如：酚和氯仿等的使用。本发明为高效快捷的微小RNA分离纯化方法，对各种不同来源的样品(动物、植物、细胞等)，尤其是液体样本，均能取得满意的提取效果。对各种小分子RNA，包括微小核糖核酸(微小RNA，miRNA)、小干扰核糖核酸(小干扰RNA，small interfering RNA，siRNA)、小核核糖核酸(小核RNA，small nμlcear RNA，snRNA)均能实现较好的回收。