[发明专利]一种快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的分子生物学方法及其引物

说明书

技术领域

本发明涉及植物病毒的分子生物学检测和鉴定技术领域，具体涉及凤仙花 坏死斑病毒的分子生物学检测和鉴定的方法及其引物。

背景技术

凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)最早从有症状的 凤仙花上分离鉴定出来，可以侵染50科648种植物，其中观赏植物39个属， 是国外花卉生产中最难解决的问题之一。该病毒为三分体基因组，其中 ssRNA-L(8.9kb)为负义，ssRNA-M(4.8kb)和ssRNA-S(2.9kb)为双义。L片段 编码一个332kDa的依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)；M片段的互补链RNA 编码两个糖蛋白G₁和G₂，病毒链RNA编码33.6kDa非结构蛋白NSm；S片段 的互补链RNA编码28.8kDa外壳蛋白(NP)，病毒链RNA编码52.4kDa非结构 蛋白NSs。1998年，INSV病毒被欧洲及地中海植物保护组织(European and Mediterranean Plant Protection Organization，EPPO)列入A2类检疫性有害生物。

目前，传统生物学测定是进行病毒检测常用的一种方法，主要是通过观察 鉴别寄主在接种后的症状反应，以及其他生物学指标，如病毒传播途径、介体 昆虫的种类、病毒寄主范围、体外保毒期、稀释限点、钝化温度及与已知病毒 的交叉保护作用和细胞质内含体形态等，作为病毒鉴定的标准。但它在检测特 定病毒时需要的特定鉴别寄主不易得到，且耗时，已不能适应生产上对快速检 测的需要。不同病毒在同种植物上常产生相同症状；同种病毒在植物的不同栽培 品种上的症状不尽一致：同种病毒的不同株系可产生不同症状；复合侵染及病毒 卫星RNA会影响症状表现；病毒常会产生潜隐侵染：不同土壤和气候条件可改变 症状表现等，使准确检测和鉴定病毒较困难。

电镜技术是通过观察植物病毒颗粒形态、大小、结构、内含体组成和亚结 构等方面的特征来确定病毒是否存在。利用电镜法鉴定植物病毒的优点是快速、 简单和直接，可以直观地观察病毒形态结构以及病毒侵染寄主后引起的细胞超 微结构变化，可以较明确的显示超微结构水平的细胞病理变化。但电镜操作需 要一定技能，而且工作比较集中，样本数量不易太大。免疫电镜技术的检测灵 敏度与ELISA(酶联免疫吸附测定法)反应相似，但不如核酸杂交技术。同时， 依据病毒粒子的大小和弯曲程度一般只能判断到科或属.对于球状病毒，因其形 态相似很难直接利用电镜确定，只能根据粒子外形进行初步判断，另外并不是 每一种病毒侵染植物都会形成内含体等特定结构，而且电镜并不是每个实验室 都能配备，这也在一定程度上制约了电镜技术在病毒检测中的广泛应用。

利用PCR(聚合酶链反应，Polymerase Chain Re-action简称PCR)和RT-PCR (反转录聚合酶链反应，reverse transcription-PCR，简称RT-PCR)方法检测植物 病毒具有灵敏、快速、特异性强等优点，其专一性和灵敏性则优于免疫学方法。 中国专利申请号为200810058612.0的“快速检测文心兰上的凤仙花坏死斑病毒 的方法”(其公开号为CN101307366A，公开日为2008年11月19日)建立了凤 仙花坏死斑病毒的RT-PCR和巢式PCR技术，其特异性和灵敏度均比常规方法 优越，但是由于设计的2对引物均是INSV病毒三分体基因组中S RNA的N基 因的片段，造成引物设计的局限性，使得必须经过测序和比对后方能避免实验 结果的假阳性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中检测凤仙花坏死斑病毒的 RT-PCR和巢式PCR技术引物设计的局限性致使假阳性结果出现的缺陷，提供一 种应用特异性引物的准确快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒病的方法。

为解决上述技术问题，本发明有下列技术方案：

1、一种快速检测和鉴定凤仙花坏死斑病毒的专用引物L6，所述的专用引物 L6是由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示， 目标产物片段长度为744bp。