[发明专利]一种快速有效获得脐带间充质干细胞(MSC)的方法

说明书

技术领域：

本发明是一种快速有效获得脐带MSC的方法，具体地说是利用细胞培养技术和合理的组织处理技术提高获得脐带MSC得率和速度，并快速鉴定的方法。

背景技术

间充质干细胞是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中。MSC具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下可分化为造血细胞、肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞。同时MSC除了具有干细胞的一般生物学特点外，还具有免疫调节功能。此外该细胞还具有来源相对方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。因此近年来MSC已成为干细胞研究中的热点，在免疫疾病治疗、造血干细胞移植、组织工程、基因工程等领域具有较好的应用前景。

MSCs可以抑制淋巴细胞的增殖，具有很强的免疫调节功能。体内实验证实，MSC移植能够明显延长移植皮肤的存活时间和减少异基因造血干细胞移植GVHD，我们也成功利用MSC移植治疗了数十例系统性红斑狼疮患者。目前认为这个MSC分泌各种免疫调节分子，与免疫细胞的接触，低免疫原性、诱导嵌合体形成从而诱导免疫耐受调控机体免疫有关。

目前的研究表明MSC还可以治疗缺血性疾病。MSC和外周血干细胞联合移植可以促进乳腺癌患者和高危急性髓性白血病患者的造血恢复，并没有相关的负作用，显示了良好的促造血恢复的能力。MSC细胞的这种治疗效果与MSC分泌各种造血因子及生成骨髓基质且有利于造血干细胞的体外扩增、造血干细胞移植后的归巢及植入、可缩短移植后骨髓造血功能恢复的时间有关。同时在大鼠大脑动脉阻塞和心肌梗死模型的研究中均发现，MSC细胞具有改善病症的作用。

同时MSC作为一种干细胞，也具有干细胞多向分化潜能，MSC可以治疗先天性骨形成不良、异染性脑白质营养不良(MLD)和赫尔利综合征，在帕金森症，老年痴呆症，脊椎损伤，烧伤的治疗也有报道。

此外MSC可以作为携带外源基因的良好载体，已经有人把细胞因子，如IL23、EPO等导入MSC细胞内，进入体内后获得长时间稳定表达。有人把IFNβ的基因导入MSC内，发现肿瘤的微环境容易使MSC植入，进入肿瘤内的MSC通过分泌IFNβ细胞因子抑制肿瘤生长，显示了MSC具有可能的肿瘤生物治疗功能。这些结果都提示了MSC广泛的治疗功能，目前世界各国均投入大量的人力物力财力进行广泛和深入的研究。但上述的治疗方案都需要大量的MSC进行移植，因此建立稳定有效快速的MSC资源库具有极为重要的意义。

一般认为MSCs在骨髓组织中的含量最丰富，但是随着年龄的老化，自体骨髓中MSCs数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退，并存在病毒感染的潜在危险，同时供体MSC的采集困难，使得寻找骨髓以外其它可替代的MSCs“资源库”的研究被提上日程。目前，已经从脂肪、胚胎、羊膜液、胎盘、脐带血以及脐带等骨髓以外的组织中分离出MSC。而在这些组织中，脐带属于医疗废弃物，最容易获得，且对其研究及应用不涉及伦理学问题，并且具有稳定大量的来源，因此具有研究的价值。目前的研究表明，脐带间充质干细胞存在于脐带沃顿胶和血管周围组织中，在该部位培养获取的成纤维细胞样，表达α-平滑肌肌动蛋白及多种MSCs标记物(CD29、CD44、CD51、CD105、SH2、SH3)，但不表达内皮或白细胞特殊抗原CD34、CD45。同时在脐带间充质干细胞培养基中加入5-氮胞苷，MSCs向心肌细胞分化，改变培养条件还可向脂肪细胞和骨细胞分化，提示了脐带MSC细胞和骨髓MSC细胞具有相同的表型和分化潜能。

目前用于分离间充质干细胞的方法主要有4种，即流式细胞分选法、磁珠分离法、密度梯度离心法和贴壁筛选法。对流式细胞分选法和磁珠分离法来说，因迄今尚未发现间充质干细胞特异性很强的表面标记物，研究者需要选用多个表面标志进行检测；此外，这两种方法对细胞活性的影响较大、实验条件要求较高，并不利于细胞的分离分选，故目前尚未广泛应用。密度梯度离心法由于需要较精密的仪器和合适的分离液，对细胞也有一定的影响，并不适合用于大规模的生产应用。而贴壁筛选法，所获的细胞形态均一，增殖速度快，生长状态稳定，且操作简便，成本低，有望成为较实用的生产方法。相关文献报道了脐带MSC细胞的获取方法，获取效率相对较低，速度较慢。我们改进了传统的内皮细胞消化方法和消化酶的配方，采用半组织贴壁方法可以大量快速的获取脐带MSC细胞。并有很高的获得效率和得率。本方法简单易行，更有利于用于生产实践。

发明内容：