[发明专利]全基因合成犬α干扰素基因及蛋白表达

说明书

一技术领域

本发明属于基因工程生物制药领域，涉及利用全基因合成技术获得犬α干扰素基因及其干扰素蛋白的原核表达。

二背景技术

近年来，养犬业在我国发展迅速，犬的种类和数量也越来越多，不论是作为伴侣动物还是凶猛灵敏的警用犬，都对现代社会起着不可或缺的作用，而病毒病如犬细小病毒病、犬瘟热、犬冠状病毒病等都严重危害着犬的健康和生存，病毒病的预防和治疗显得尤为重要。干扰素系统是机体对抗病毒感染的重要防御系统，当干扰素系统被激活后，血清干扰素可以在几分钟之内扩散到身体各器官，而细胞接触干扰素只需几分钟就可产生抗病毒状态，而且，动物可以在一到三周内对其他病毒的重复感染有抵抗作用。根据干扰素的氨基酸序列、抗原性和细胞来源的不同可将其分为2个型：I型干扰素的主要成员为α干扰素和β干扰素，II型干扰素为γ干扰素。而其中α干扰素(IFN-α)以其突出的抗病毒作用而备受人们重视。

由诱生剂诱导产生的天然犬IFN-α，因来源少、成本高、纯化工艺复杂等诸多原因而价格昂贵，极大的限制了临床和科研的应用，而利用基因工程技术选择一个合适的系统，使其得到高效表达，生产具有廉价、广谱抗病毒活性、无毒害、无残留等优点的干扰素已经无疑是促使干扰素在兽医临床上推广应用的有效途径。

三发明内容

本发明的目的之一在于对犬α干扰素基因序列进行密码子改造后，通过全基因合成技术合成此序列并构建高效表达载体，实现干扰素在大肠杆菌的高表达，获得具有抗病毒活性的犬α干扰素蛋白。

本发明的另一目的是提供一种通过全基因合成技术合成的经过改造的核酸，其特征在于：所述核酸包含编码犬α干扰素的阅读框，并且在该阅读框内全部采用大肠杆菌偏爱的密码子。

优选的，上述阅读框的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一目的是提供一种含有上述核酸的重组载体。

本发明的另一目的是提供一种含有上述重组载体的大肠杆菌。

本发明还提供一种在原核表达系统中提高犬α干扰素表达量的方法，其包含如下步骤：(1)在不改变犬α干扰素氨基酸序列的基础上设计其编码核酸序列，使阅读框内的每个密码子都采用大肠杆菌偏爱的密码子；(2)人工合成步骤(1)中设计的编码核酸；(3)将步骤(2)合成的核酸插入适当的表达载体，构建重组表达载体；(4)将步骤(3)构建的重组表达载体转化适当的大肠杆菌进行诱导表达。

本发明的技术方案如下：

(一)犬α干扰素基因的合成

(1)登录GeneBank，查找编码犬α干扰素成熟蛋白的基因序列；

(2)利用SignalP 3.0Server软件预测此基因序列有无信号肽及其位置；

(3)利用TargetP 1.1Server软件检测此信号肽的功能；

(4)将犬α干扰素的编码密码子与大肠杆菌偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，将犬α干扰素密码子替换为大肠杆菌偏好的密码子；

(5)将替换后的序列5′、3′端分别加上EcoRI、XhoI酶切位点，送生物公司进行全基因合成；

(二)犬α干扰素的原核表达

(1)重组质粒pET32a-CaIFN-α转化大肠杆菌BL21(DE3)；

(2)阳性重组菌诱导表达，最佳诱导时间的确定及表达蛋白可溶性鉴定；

(3)重组阳性菌稳定性检测；

(三)重组犬α干扰素的提取

(1)菌体破碎；

(2)包涵体洗涤；

(3)包涵体变性；

(4)目的蛋白透析复性及蛋白浓度测定；

(四)重组犬α干扰素抗病毒活性测定

利用微量病变抑制法测定干扰素活性

(1)培养MDCK细胞；

(2)接种96孔细胞板；

(3)滤泡性口炎病毒(VSV)对MDCK半数致死量的测定；

(4)干扰素抗VSV活性测定，将抑制50％细胞病变的干扰素的最高稀释度定为1个干扰素单位。

四附图说明

图1是重组犬α干扰素蛋白表达SDS-PAGE电泳图

泳道1：诱导表达前；

泳道2-7：诱导表达1，2，3，4，5，6小时；

泳道7：蛋白质分子量标准(Marker)。

重组菌经诱导表达后在分子量32kD处有增加的蛋白表达条带，与预期的蛋白分子量一致(干扰素分子量18.0kD，加上载体本身的融合标签14.3kD)，且在6小时时表达量最高，所以选用的最佳诱导时间为6小时。

图2是重组犬α干扰素蛋白可溶性鉴定图