[发明专利]一种具抑菌活性的中华绒螯蟹乳清酸蛋白的制备及应用

说明书

技术领域：

本发明涉及中华绒螯蟹乳清酸蛋白(Es-WAP)基因的体外重组表达技术及其功能鉴定。本发明利用体外重组表达技术获得了中华绒螯蟹乳清酸蛋白Es-WAP，该重组蛋白对毕赤酵母GS115，平滑假丝酵母和鳗弧菌具有抗菌作用，在开发抗菌类药物和饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。 

背景技术：

生物的免疫机制可分为两大类，固有免疫和获得性免疫。无脊椎动物缺乏获得性免疫机制只能依靠固有免疫来抵御病害侵害。近年来在动物的乳清中发现一种乳清酸蛋白，它具有一个或多个乳清酸蛋白(WAP)结构域，该蛋白具有蛋白酶抑制活性，抗菌活性，ATP酶抑制活性以及细胞增殖调控等重要生物学作用。在对虾，中华绒螯蟹等甲壳动物中已报道多种单一WAP结构域壳质素抗菌肽，具有抗革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的活性，目前在无脊椎动物凡纳滨对虾中首次发现两个WAP结构域蛋白，具有蛋白酶抑制活性。 

2008年全世界水产养殖总产量为5170万吨，产值788亿美元，其中甲壳类养殖产量为450万吨，产值143.61亿美元。中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)属于甲壳动物，是我国重要的水产养殖品种之一。然而，与其它甲壳类养殖品种一样，病害发生日益频繁，尤其是病毒、细菌、真菌等微生物引起的传染性疾病，每年均造成巨大的经济损失，严重阻碍了甲壳动物养殖业的发展。目前，蟹病防治主要是采用抗生素药物防治，但长期盲目滥用药物，造成抗药性问题日益严重，非但难以有效地控制病情，反而带来资金的浪费，蟹品质的下降，环境污染及对人类健康构成潜在威胁等不良后果。因此，开展中华绒螯蟹免疫机制研究，为蟹病的防治寻找更科学有效的途径，以期通过蟹自身免疫抵抗力的提高来防止和减少蟹病的发生，具有十分重要的理论与实践意义。中华绒螯蟹乳清酸蛋白的编码区有一个22个氨基酸的信号肽和两个WAP结构域，说明中华绒螯蟹乳清酸蛋白是一种分泌蛋白，可能在蟹免疫防御中发挥着非常重要的作用。 

发明内容：

本发明采用通过PCR技术扩增乳清酸蛋白成熟肽编码区基因片段进行了原核重组表达。为确认其蛋白功能，深入研究重组蛋白(rEs-WAP)对毕赤酵母GS115，平滑假丝酵母和鳗弧菌的抑菌能力，为抗菌药物的筛选提供指导。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：采用技术PCR扩增含两个WAP结构域的编 码区基因片段，将其克隆到pET-32a(+)表达载体中，获得重组载体pET-32a(+)-WAP，随后转入宿主细胞BL21(DE3)Plys中实现原核体外重组表达。经镍琼脂糖凝胶纯化获得EsWAP重组蛋白，透析复性后，当蛋白浓度为222μg mL^-1时，对毕赤酵母GS115，平滑假丝酵母有显著的抑菌作用，对鳗弧菌的生长有极显著的抑菌作用(附图1所示)，蛋白浓度经梯度吸收后，重组蛋白对毕赤酵母GS115、平滑假丝酵母、鳗弧菌的最小抑菌浓度分别为7.0μg mL^-1、27.8μg mL^-1、55.5μg mL^-1(附图2所示) 

附图说明

图1.222μg mL-1Es-WAP重组蛋白产物的抑菌活性统计结果 

图2.不同浓度梯度的Es-WAP重组蛋白对毕赤酵母GS115的抑菌效果 

图3.不同浓度梯度的Es-WAP重组蛋白对平滑肌假丝酵母的抑菌效果 

图4.不同浓度梯度的Es-WAP重组蛋白对鳗弧菌的抑菌效果 

具体实施方式：

下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。 

实验例1： 

本发明的中华绒螯蟹乳清酸蛋白Es-WAP基因编码区体外原核重组表达，包括下列步骤： 

1、重组载体的构建