[发明专利]一种检测凤仙花坏死斑病毒的实时荧光定量RT-PCR方法及其引物、探针和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及植物病毒分子生物学检测和鉴定技术领域，具体涉及针对凤仙 花坏死斑病毒的TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法以及所用的引物和探 针。

背景技术

凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)是危害观赏植物 的重要病害之一，也是国外花卉生产中最难解决的问题之一。1998年INSV被 欧洲及地中海植物保护组织列入A2类检疫性有害生物。

凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus，INSV)属于布尼亚病毒 科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)。该病毒粒子为球形，直径 80-120nm，病毒有包膜，其基因组由3个单链RNA分子构成。凤仙花坏死斑病 毒最早从有症状的凤仙花上分离鉴定出来，可以侵染50科648种植物，其中观 赏植物39个属、蔬菜6个属。INSV引起的症状多样，随寄主和侵染时期不同而 变化，主要表现为矮化、环斑、叶片或茎部的褐色至紫色的斑点、茎部变褐(溃 疡)、碎色花，病害严重发生时会造成许多观赏植物的矮化，甚至植株死亡，严 重影响观赏植物的经济价值。

目前传统生物学测定、现代电镜技术、血清学技术、常规RT-PCR技术等已 经广泛用于INSV病毒的诊断。然而传统生物学测定是通过观察鉴别寄主在接种 后的症状反应，以及其他生物学指标作为病毒鉴定的标准；现代电镜技术是通 过观察植物病毒颗粒形态、大小、结构、内含体组成和亚结构等方面的特征来 确定病毒是否存在；常规PCR(聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction简称 PCR)能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增 至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。中国专利申请号为 200810058612.0的“快速检测文心兰上的凤仙花坏死斑病毒的方法”(其公开 号为CN101307366A，公开日为2008年11月19日)建立了凤仙花坏死斑病毒的 RT-PCR和巢式PCR技术，其特异性和灵敏度均比常规方法优越，但是其仅能够 定性检测凤仙花坏死斑病毒，不能实现对病毒样品的定量检测。

目前生物学中定量检测的方法有转磷光免疫层析技术、实时荧光定量PCR 技术等，其中实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR)技术在目前定量检测技术中使用最广泛，精确度最高。普通PCR技术可 对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，可以通过凝胶电 泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光 密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。 但是在许多情况下，人们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量， 例如，如果想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定 组织中的表达量，在这种需求下本发明构建了实时荧光定量RT-PCR(RT-PCR即 反转录聚合酶链反应，reverse transcription Polymerase Chain Reaction简 称RT-PCR))，构建出适宜检测凤仙花坏死斑病毒的专用引物、探针和检测优化 条件等，它是在常规PCR基础上把荧光共振能量转移与荧光标记探针结合，巧 妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术融合在一起的一项创造性技 术，迄今为止，没有发现公开发表的与本发明相类似检测凤仙花坏死斑病毒的 发明专利。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术在对凤仙花坏死斑病毒定量检测 方面的缺陷，其目的是提供一种基于TaqMan探针的检测凤仙花坏死斑病毒的实 时荧光定量RT-PCR方法，同时，本发明还提供用于对凤仙花坏死斑病毒进行实 时荧光定量RT-PCR检测的引物，以及对凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量 RT-PCR检测的TaqMan探针及其试剂盒与应用。

为解决上述技术问题，本发明有下列技术方案：

1、一种用于对凤仙花坏死斑病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的引物， 所述的引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表 中SEQ ID NO：1所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所 示，目标产物片段长度为182bp。