[发明专利]用于检测人乳头瘤病毒的引物组合物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种用于检测人乳头瘤病毒的引物组合物、试剂盒及方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是一种小的DNA双链病毒，目前已分离出100余种HPV DNA，其中40多种与宫颈的感染和病变有关。根据致病力的大小，HPV可分为高危型和低危型两种，低危型主要引起生殖道、肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤样变(CIN)；高危型主要导致CIN II、III级病变和宫颈癌的发生。持续高危型HPV感染是CIN进一步发展为宫颈癌的必经过程，从感染高危型HPV开始至发展为宫颈癌的时间间隔大约为15年，故宫颈癌是可预防的特殊癌症。

目前，流行病学和生物学已经证明HPV感染是引起宫颈癌及其癌前病变的首要原因。因此，对HPV进行检测及分型对于有效的、可靠地筛查宫颈癌具有重要的参考意义。传统的HPV检测方法有巴氏涂片法、液基层细胞学检查、阴道镜检查、组织病理学检查、电镜直接观察、放射免疫沉淀法检查、酶联免疫吸附法检查等，但是这些检测方法的灵敏度和准确率均不够理想。最近几年，为了克服传统检测方法的不足，开始采用新的分子生物学检测方法对HPV进行检测，包括核酸杂交法、聚合酶链反应PCR法、荧光免疫检测法等，但是这些方法仍然操作繁琐且价格昂贵。

因此，开发一种简单、易行、成本较低的检测HPV的方法就显得尤为重要。

发明内容

因此，本发明的一个目的在于提供一种用于检测人乳头瘤病毒的引物组合物。

本发明的另一个目的在于提供上述引物组合物在制备用于检测人乳头瘤病毒的工具中的用途。

本发明的另一个目的还在于提供一种用于检测人乳头瘤病毒的试剂盒。

本发明的又一个目的在于提供一种检测人乳头瘤病毒的方法。

本发明经过大量试验、研究和分析，成功地将一系列能够用于快速、灵敏、有效检测HPV的通用混合引物与经实验筛选出的内参引物相组合，开发出一种用于检测HPV的引物组合物及相应的工具、试剂盒和方法。利用它们可以检测出50多种型别的HPV，它们分别为HPV 6、11、16、18、26、30、31、32、33、34、35、39、40、42、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、62、66、67、68、69、70、71、72、73、74、81、83、84、85、89、MM8(Pap155)、MM7(Pap291)、MM4(W13B)、IS39、C6108、C8304、C8061、AE2(82亚型)、AE10(74变体)，其中包括了所有可能导致宫颈癌的高危型和低危型HPV。

本发明的上述目的是采用以下技术方案来实现的。

一方面，本发明提供的用于检测人乳头瘤病毒的引物组合物，该引物组合物包括用于检测人乳头瘤病毒的混合引物以及内参引物，其中用于检测人乳头瘤病毒的混合引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：2；内参引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：3，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明还提供了上述引物组合物在制备用于检测人乳头瘤病毒的工具中的用途。

另一方面，本发明提供了一种用于检测人乳头瘤病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述用于检测人乳头瘤病毒的引物组合物。该试剂盒还可以包括细胞裂解液、核酸结合液、核酸漂洗液、核酸洗脱液和PCR反应液。

又一方面，本发明提供了一种检测人乳头瘤病毒的方法，该方法包括以下步骤：1)提取样本DNA；2)使用上述引物组合物或试剂盒对步骤1)提取的DNA进行PCR扩增；3)检测步骤2)得到的扩增产物。其中，上述步骤1)中的样本优选为人宫颈上皮细胞；上述步骤3)中的检测方法可以为琼脂糖凝胶电泳法或微流体芯片检测法，优选为微流体芯片检测法。

采用本发明的上述引物组合物及其工具、试剂盒和方法能够快速、准确、简便地检测患者样品DNA中的HPV L1保守序列(各分型的病毒株上均有该序列)，从而判断患者是否感染了HPV，其中具体包括以下步骤：

1)提取人临床样本的DNA；

2)将HPV L1保守序列的特异性混合引物(对应的核苷酸序列为SEQID NO：1和2)和人DNA保守序列特有基因的特异性引物(对应的核苷酸序列为SEQ ID NO：3和4)组合，对被测样本的DNA进行多重PCR扩增，被扩增的目标基因片段大小各不相同；