[发明专利]嵌合狂犬病病毒株rLEP333Q-L(H)的构建及其生物学功能的研究

说明书

技术领域

本发明涉及重组疫苗领域，具体地涉及一种用于制备弱毒疫苗的嵌合 狂犬病病毒株rLEP333Q-L(H)，本发明还涉及所述病毒株的应用。

引言

狂犬病是一种很重要的人畜共患病，在世界范围内每年约有60,000 余人死于狂犬病^[1]，引起严重的公共健康问题。狂犬病病毒属于弹状病毒 科、狂犬病毒属，为不分节段单股负链RNA病毒，其基因组长约12kb， 共编码5个结构蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖 蛋白(G)和RNA聚合酶(L)。依赖RNA的RNA聚合酶L是狂犬病病 毒中最大的结构蛋白，是一多功能酶，在病毒基因组复制、转录及转录后 的加工，包括甲基化戴帽和多聚腺苷酸化等方面发挥作用。

1940年，Koprowski等人从病死女孩脑内分离到狂犬病毒Flury株， 经1日龄雏鸡脑内、鸡胚卵黄囊传代后，再经鸡胚传代178代以上，无论 神经内、外接种都对动物丧失致病力，但新生乳鼠和猴在脑内接种时仍具 有残留毒力^[2]。在鸡胚传代68代以前的称为“LEP”(鸡胚低代株)，高于136 代的称为“HEP”(鸡胚高代株)。LEP脑内感染成年小鼠致死，而HEP脑内 感染成年小鼠不致死。Flury-LEP株具有优良的免疫原性，被广泛用作人 或动物的狂犬病灭活疫苗种毒株。WHO对使用狂犬病病毒弱毒活疫苗的 要求是小鼠脑内感染不致死，因此，有待对LEP株进行改造，以期获得安 全有效的活疫苗推荐株。

为获得安全、高效的狂犬病弱毒活疫苗株，本研究利用反向遗传技术 构建了将LEP的糖蛋白第333位精氨酸(Arg)突变为谷氨酰胺(Gln)， 同时将L基因替换为HEP的L基因的嵌合病毒rLEP333Q-L(H)。我们鉴 定了该嵌合病毒株的生物学特性，并将其与Flury-LEP、HEP进行了比较。 结果表明重组病毒rLEP333Q-L(H)具有很好的安全性和免疫原性，适用于 作为狂犬病病毒弱毒疫苗的开发。

发明内容

在第一个方面中，本发明提供一株嵌合狂犬病病毒株，该嵌合病毒是 在亲本弱毒疫苗株Flury-LEP基础上，将G蛋白第333位精氨酸突变为谷 氨酰胺，同时将LEP的L基因替换为HEP的L基因，并拯救获得的感染 性病毒颗粒。

在第一个方面的一个实施方案中，其中构建的病毒株为 rLEP333Q-L(H)。

在第一个方面的一个实施方案中，所述Flury-LEP的全长基因组cDNA 序列如SEQ ID NO：1所示。

在第一个方面的一个实施方案中，其中所述HEP的L基因的序列如 SEQ ID NO：8所显示。

在第二个方面中，本发明提供一种构建第一方面的病毒株的方法，所 述方法包括下列步骤：

1)构建转录质粒，所述转录质粒包含将G蛋白第333位精氨酸突变 为谷氨酰胺，同时将LEP的L基因替换为HEP的L基因的Flury-LEP全 长基因组cDNA序列；

2)构建一个或多个转录辅助质粒，所述辅助质粒包括编码狂犬病病毒 Flury-LEP核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L基因的开放阅读框架的 cDNA序列；

3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染允许狂犬病病毒Flury-LEP 弱毒疫苗株复制的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

4)收获上清液，获救嵌合病毒株。

在第二个方面的一个实施方案中，其中所述转录质粒为 pCI-LEP333Q-L(H)。

在第二个方面的一个实施方案中，其中所述转录辅助质粒分别为 pCAGG-N、pCAGG-P或pCAGG-L。

在第二个方面的一个实施方案中，其中所述宿主细胞为真核细胞。

在第二个方面的一个实施方案中，其中所述真核细胞为BHK-21细胞。

在第三个方面中，本发明提供一种载体，其包含将G蛋白第333位精 氨酸突变为谷氨酰胺，同时将LEP的L基因替换为HEP的L基因的 Flury-LEP全长基因组cDNA序列。

在在第三个方面的一个实施方案中，所述Flury-LEP的全长基因组 cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

在第三方面的一个实施方案中，其中所述HEP的L基因的序列如SEQ ID NO：8所显示。