[发明专利]一种筛选抗酚发根农杆菌菌株的方法

说明书

技术领域  本发明涉及一种筛选抗酚发根农杆菌菌株的方法。属于植物基因工程技术领域。

背景技术  发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是植物遗传转化及转基因研究的一种重要工具，它属根瘤菌科(Rhizobiaceae)，农杆菌属(Agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌。茶树(Camellia sinensis)是一种富含儿茶素等多酚类物质的多年生木本植物，大量研究表明：茶树中的这类多酚类物质具有明显的杀菌或抑菌作用[杜晓，李宁，周茹娟，等.植物中分离的儿茶素类及其聚合物的抑菌作用[J].四川农业大学学报.2005，23(3)：374-378.；王静，戚向阳，朱学良，等.表没食子儿茶素没食子酸酯及其不同氧化级分的抑菌活性研究[J].天然产物研究与开发.2008：-.]，这种抑菌作用将直接阻碍发根农杆菌对茶树的遗传转化，这也就是国内外发根农杆菌介导茶树遗传转化率极低[张广辉，梁月荣，陆建良.发根农杆菌介导的茶树发根高频诱导与遗传转化[J].茶叶科学.2006，26(1)：1-10.；奚彪，刘祖生，梁月荣，等.发根农杆菌介导的茶树遗传转化[J].茶叶科学.1997，17(增刊)：155-156.；Zebra M，Banerjee S，Mathur A K，et al.Induction of hairy roots in tea(Camellia sinensis L.)[J].Current Science.1996，70(1)：84-86.]及茶树转基因育种难以成功的主要原因。

发明内容  本发明的目的是提供一种筛选抗酚发根农杆菌菌株的方法，通过该方法获得抗酚性较强的菌株，使之在介导茶树等富含多酚类的植物时仍具有相当高的活性，应用该方法获得的抗酚性强的菌株可提高茶树的发根诱导频率及发根密度，为发根农杆菌介导的遗传转化应用于茶树研究解决一大难题。

本发明提供的技术方案是：一种筛选抗酚发根农杆菌菌株的方法，将发根农杆菌菌株(Agrobacterium rhizogenes)转接到含卡那霉素的YEB液体培养基进行菌种活化，然后将此活化菌液100μl涂布在含有茶多酚浓度为25-800μg/ml以及含卡那霉素的AB固体培养基上进行抑菌培养24-48小时，挑取在200μg/ml茶多酚浓度下仍能生长的单菌落，再转接到含200μg/ml浓度茶多酚的含卡那霉素的AB液体培养基进行菌种活化，然后将活化的菌液100μl分别涂布到含200、400、800和1000μg/ml浓度的茶多酚的含卡那霉素的AB液体培养基的平板进行再次抗酚筛选和活化培养，依此进行2-3次抗酚筛选直至获得在800-1000g/ml浓度茶多酚培养基仍然能生长形成菌落的抗酚性强的发根农杆菌菌株。

所述含卡那霉素的YEB液体培养基由下法得到：将1g酵母提取物，5g牛肉浸膏，5g蛋白胨，0.5gMgSO₄·7H₂O，5g蔗糖溶解到900ml的蒸馏水中，再用1NnaOH调节pH值至7.2，然后用蒸馏水定容至1000ml，蒸汽灭菌，待培养基温度降至60℃以下加入经0.22μ微孔滤膜过滤灭菌的浓度100mg/ml卡那霉素1ml。