[发明专利]纳米金结合聚噻吩衍生物比色检测目标靶DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纳米金结合聚噻吩衍生物比色检测目标靶DNA的方法。更确切地说，特别是涉及一种复合纳米金和聚噻吩灵敏快速检测目标靶DNA的方法。属靶基因检测领域。

背景技术

人类、病毒以及细菌的特异性核酸序列检测在疾病诊断中正变得越来越重要。尤其近年来一些病原体引起的爆发性疫情给人类的健康以及社会经济带来严重损失。因此，对病原体进行快速、准确的诊断不仅对传染性疾病的预防和控制有着非常重要的意义，对临床疾病的指导也起着积极的指导意义。至今为止许多技术，包括电化学、荧光、电泳、电化学发光、酶、表面等离子共振(SPR)以及原子力显微镜等方法被用于人类和病原体基因的检测。这些技术方法尽管有其各自的优势以及较高的灵敏度，但大多需要基因的扩增以及昂贵的检测仪器等，最近几年来许多研究都在努力提高目标靶基因检测的敏感度而不需要靶序列的扩增和富集的过程。然而，大多数这些方法仍需要复繁琐的步骤。因此建立简单、特异、快速的基因检测方法对疾病的早期诊断具有重要的意义。

近年来，金纳米颗粒和水溶性荧光共轭聚合物作为高灵敏的生化传感元件的独特性质在生物大分子(如核酸、蛋白质)特异性识别、检测方面的研究越来越受到人们的关注。纳米金颗粒具有很好的生物相容性，颗粒直径小，比表面积大，在可见区内具有较高的消光系数和特殊的光学性质，因此可作为一个信号分子识别的理想颜色显示剂，用于DNA杂交的比色分析检测。但是通常需要在纳米金颗粒表面修饰寡核苷酸探针，才能达到特异性识别靶生物分子的目的，因此成本较昂贵。研究表明，ssDNA和dsDNA对未标记的纳米金颗粒有不同的静电作用，因而对纳米金颗粒的稳定性有所不同，根据此特性可以鉴别ssDNA和dsDNA。另一方面，携带着离子功能的共轭聚合物也一直是高性能和快速反应的化学和生物传感器运用的候选者。例如聚噻吩衍生物为带正电离子、有荧光色团的水溶性多聚物，在能量转换、机械压力以及离子结合的情况下可显示出明显的颜色变化。因此，用聚噻吩作为传感材料的传感器已引起研究者的广泛注意。聚噻吩可以与带负电离子的寡聚核苷酸结合形成化学计量的聚合电解质复合物(二聚体)，而使聚噻吩衍生物本身的荧光淬灭而呈现红光；当未标记的互补的寡核苷酸探针增加到多聚物中，聚合电解质复合物进一步与完全互补的寡聚核苷酸结合形成三聚体，此时聚噻吩衍生物骨架紧密地缠绕在双链互补核苷酸骨架的带负离子的磷酸上形成了一个螺旋结构，从而限制了链内和链间的荧光淬灭导致荧光信号增强发出黄色的光谱，并且从颜色上也可辨别出明显的改变，最关键的是聚噻吩衍生物本身能够产生信号级联放大，这为低浓度基因的检测提供了一种新方法。

鉴于以上对纳米金和聚噻吩衍生物作为高灵敏度的生化传感元件的独特特性，本发明试图将两者结合起来用生物比色方法检测目标靶DNA，本发明是基于纳米金结合聚噻吩衍生物为传感材料的非标记DNA检测方法，为了增加这个传感器的选择性和敏感性，未修饰的聚噻吩衍生物被用于做颜色变化和扩增指示剂。该发明基于聚噻吩衍生物与ssDNA/dDNA结合时使得DNA-纳米金溶液的稳定性发生变化而引起颜色改变产生信号级联放大的原理，通过颜色转变显示剂以及扩增标签的双重作用实现DNA的高灵敏快速检测，从而建立利用纳米金结合聚噻吩衍生物进行基因直接检测的分析平台。该复合纳米金和聚噻吩作为传感材料用于DNA的检测比纳米金和聚噻吩单独作为传感材料用于DNA的检测灵敏度大大提高，并且操作简单，不需要特殊的仪器设备，可望应用于临床检验医学及环境中靶目标DNA的快速诊断和检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纳米金结合聚噻吩衍生物快速检测目标靶DNA的方法，以弥补现有技术中的缺陷。

本发明提供一种纳米金结合聚噻吩选择性灵敏检测目标靶DNA的方法，包括：

(一)检测试剂及探针的准备

(1)纳米金溶液的制备

配置浓度为1mM HAuCl4溶液及浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液。将HAuCl4溶液加热至130℃，保证加热过程中搅拌充分，约20分钟时迅速加入新配好的柠檬酸三钠溶液(此过程中注意保温，不要让HAuCl4溶液降温)25ml，持续搅拌至溶液冷却至室温、即形成为酒红色溶液。以0.22μm硝酸纤维尼龙膜过滤溶液，即可得到颗粒均匀的13nm纳米金溶液，4℃保存备用。

(2)H1N1 DNA检测探针的设计及合成