[发明专利]黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物及其制备方法

说明书

技术领域

涉及一种治疗痛风和高尿酸血症的黄曲霉尿酸氧化酶修饰物，尤其涉及一种活性高的黄曲霉尿酸氧化酶聚乙二醇修饰物及其制备方法。 

背景技术

人体嘌呤代谢的最终产物是尿酸，与其他自身表达有活性尿酸氧化酶的物种不同，尿酸不能被进一步氧化分解为容易排除体外的尿囊素。在疾病、遗传或者饮食等因素的影响下，尿酸会在血液、尿液及组织液中积累，浓度逐渐升高，当超过了其溶解度时，就会增加肾脏负担，造成肾功能的损伤，特别是长期的尿酸水平升高，会导致尿酸盐结晶在血流相对不太丰富的关节、皮下组织沉积，形成痛风石。不定期的痛风发作，不但病人非常痛苦，还有可能造成关节畸形、致残。 

目前治疗痛风主要使用抗炎药物和降尿酸药物，代表性药物有秋水仙碱、非甾体抗炎药、肾上腺皮质激素、别嘌呤醇、丙磺舒、溴苯马龙等，这些药物都需要长期服药，而且具有明显的副作用。尿酸氧化酶(Urate Oxidase，UOX)能够有效分解尿酸为更容易排除体外的尿囊素，其降低尿酸水平的作用方式与其他药物不同，给药后迅速发挥降尿酸作用，副作用小。2002年美国食品药品监督管理局批准原型重组尿酸氧化酶Rasburicase用于治疗儿童肿瘤放化疗引起的高尿酸血症。近几年有尿酸氧化酶用于痛风治疗的临床研究报道，特别是不能耐受别嘌呤醇治疗的患者(Rasburicase for tophaceus gout treatment，Ribeiro A et al，ActaReumatol Port.2009 Jul-Sep；34(3)：551-4；Urate oxidase(rasburicase)for treatment ofsevere acute gout：a case report，Wipfler-Freiβmuth E.et al，Clin Exp Rheumatol.2009Jul-Aug；27(4)：658-660)，取得了很好的治疗效果。但是原型重组尿酸氧化酶在体内半衰期短，免疫原性强，限制了其在痛风治疗中的应用。 

用聚乙二醇(Polyethlene glycol，PEG)修饰尿酸氧化酶来降低免疫原性、延长半衰期已有多份报道。中国专利CN1322141A中，发明人对早期的研究作了总结，见说明书第6-8 页“表1：先前研究中PEG-尿酸氧化酶的特征”。上述表1共总结了14份先前的研究文件，其中采用假单丝酵母来源地尿酸氧化酶的文献11份，来源于猪肝的尿酸氧化酶的文献1份，未报道尿酸氧化酶来源的文献2份。表1所列文献采用的PEG分子类型包括5KD线形PEG(9份)、2＊5KD分支PEG(3份)以及0.7、7.5、10KD线形PEG各1份。表1所列文献总体上揭示了PEG修饰活性蛋白质的一股性规律，即随着PEG修饰程度的增高，所修饰的尿酸氧化酶的活性相对于天然酶活性降低，同时修饰产物的免疫原性降低。但是，上述文献并没有揭示出一种技术方案，该技术方案制备的PEG-尿酸氧化酶的剩余酶活性、半衰期、免疫原性能够满足临床用药的要求。 

在CN1322141A中，发明人公开了修饰的尿酸氧化酶活性保持在原型酶75％以上的修饰方案，PEG的修饰程度(以每个尿酸氧化酶亚基偶联的PEG分子的数量计)随不同来源地的尿酸氧化酶、不同分子量的PEG分子而不同。例如，猪-狒狒嵌合UOX，PEG分子量在2-10条/亚基，酶活性均能保持在75％以上，然而，大豆UOX仅在2条/亚基时，才能保持75％以上的活性；对于黄曲霉UOX，当5KD的PEG为12条/亚基或30KD的PEG为7条/亚基，能保持75％以上的活性；对于球形节杆菌UOX，则仅在30KD的PEG为2条/亚基时，才能保持75％以上的活性。发明人的研究结果揭示了一种趋势，随着修饰程度的增加，尿酸氧化酶的活性总体上趋于下降。发明人研究结果显示的另一方面是：大分子量的PEG(10-30KD)相对于小分子量的PEG(5KD)修饰物，能保持更高的活性。发明人的研究结果还显示，相对于单假丝酵母、黄曲霉、大豆来源地尿酸氧化酶，来源于猪的尿酸氧化酶，尤其是一种猪-狒狒嵌合的尿酸氧化酶，经PEG修饰后能保持更高的酶活性。见图1-图5、实施例4-12。