[发明专利]二羟基丙酮激酶的原核表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种原核表达载体，含有巴斯德毕赤酵母的DAK基因。

2.如权利要求1所述的原核表达载体，其特征在于所述原核表达载体的起始载体为pET-28a。

3.如权利要求1所述的原核表达载体，其特征在于所述DAK基因上游添加有T7的启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操纵子序列，紧靠DAK基因的起始密码子上游还有6个组氨酸标签序列。

4.如权利要求1所述的原核表达载体，其特征在于上述载体中的二羟丙酮激酶基因DAK来源于毕赤酵母，其GenBank登录号为AF019198。

5.一种原核表达载体，由下述方法构建而得：

(1)从GenBank中查找巴斯德毕赤酵母DAK的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物：

DAK5：5’-CATGGCTAGTAAACATTGGGATTAC-3’

DAK3：5’-CTCGAGCAACTTGGTTTCAGATTTGAAG-3’

5’端引物添加一个C碱基，并由此形成NcoI酶切位点；3’端引物末端加XhoI酶切位点；以毕赤酵母基因组为模板通过PCR扩增，得到DAK的全长DNA序列；

(2)回收并纯化DAK全长基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-DAK；

(3)构建原核载体pET28a-DAK，用NcoI和XhoI双酶切pMD-DAK和pET28a，并回收纯化的DAK基因片段以及载体片段pET28a，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得原核表达载体pET28a-DAK。

6.权利要求1-5的原核表达载体在制备重组DAK蛋白中的应用。

7.权利要求1-5的原核表达载体在制备DAK特异性抗体中的应用。

8.权利要求1-5的原核表达载体的构建方法，包括下列步骤：

(1)从GenBank中查找巴斯德毕赤酵母DAK的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物：

DAK5：5’-CATGGCTAGTAAACATTGGGATTAC-3’

DAK3：5’-CTCGAGCAACTTGGTTTCAGATTTGAAG-3’

5’端引物添加一个C碱基，并由此形成NcoI酶切位点；3’端引物末端加XhoI酶切位点；以毕赤酵母基因组为模板通过PCR扩增，得到DAK的全长DNA序列；

(2)回收并纯化DAK全长基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-DAK；

(3)构建原核载体pET28a-DAK，用NcoI和XhoI双酶切pMD-DAK和pET28a，并回收纯化DAK基因片段以及载体片段pET28a，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得原核表达载体pET28a-DAK。