[发明专利]致病菌的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病原微生物检测方法，尤其是涉及一种双砷染料-四半胱氨酸重组噬菌体对致病菌进行快速鉴别诊断的方法和应用。

背景技术

快速、灵敏、特异的致病菌检测分析对食品安全、环境监测、疾病诊断治疗和生物恐怖袭击的防范等具有重要意义。传统的病原微生物检测方法需要对细菌进行分离、培养及一系列生化反应，操作复杂、检测周期长，且无法适用于难以培养的病原菌，远不能满足实际需求([1]Iqbal，S.S.，et al.，A review of molecular recognition technologies for detection of biologicalthreat agents.Biosens Bioelectron，2000.15(11-12)：549-578；[2]Deisingh，A.K.and M.Thompson，Strategies for the detection of Escherichia coli O157：H7 in foods.J Appl Microbiol，2004.96(3)：419-429)。近年来，运用分子生物学及生物技术的最新研究成果，科研人员发展了一系列新的细菌快速检测技术，如PCR相关技术、基因芯片技术、ELISAs技术、噬菌体鉴定技术、流式细胞检测技术和生物传感技术等等([3]Hahn，M.A.，J.S.Tabb，and T.D.Krauss，Detectionof single bacterial pathogens with semiconductor quantum dots.Anal.Chem.，2005.77(15)：4861-4869；[4]Czechowska，K.，D.R.Johnson，and J.R.van der Meer，Use of flow cytometricmethods for single-cell analysis in environmental microbiology.Curr Opin Microbiol，2008.11(3)：205-212；[5]Karo，O.，et al.，Bacteria detection by flow cytometry.Clin Chem Lab Med，2008.46(7)：947-953.)。其中，流式细胞术(flow cytometry，FCM)因其具有检测速度快、精度高和多参数分析等特点，在细菌检测和鉴定方面独具优势，已成为产品质量控制、细菌致病机理以及微生物群落结构研究的重要手段([4]Czechowska，K.，D.R.Johnson，and J.R.van der Meer，Use of flow cytometric methods for single-cell analysis in environmental microbiology.Curr OpinMicrobiol，2008.11(3)：205-212)。例如，通过对细菌的核酸或蛋白进行荧光标记，FCM可以快速、准确地检测样本中的细菌总数、活菌数目和死菌数目。随着技术的不断改进，流式技术在细菌检测方面的成功应用层出不穷，Hammes等([6]Hammes，F.，et al.，Flow-cytometrictotal bacterial cell counts as a descriptive microbiological parameter for drinking water treatmentprocesses.Water Res，2008.42(1-2)：269-277)用FCM快速检测饮用水中污染的细菌数量，灵敏度比传统的平板培养法高出两个数量级；Burney等([7]Berney，M.，et al.，Assessment andinterpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flowcytometry.Appl Environ Microbiol，2007.73(10)：3283-3290)用FCM通过LIVE/DEAD荧光试剂盒鉴定了多种细菌的生理性能；流式细胞技术结合荧光原位杂交可以识别特定的核苷酸靶标，已被应用于基于16S rRNAs的细菌特异性识别及筛选表达特异mRNA的细菌([8]Jen，C.J.，et al.，Flow-FISH analysis and isolation of clostridial strains in an anaerobic semi-solidbio-hydrogen producing system by hydrogenase gene target.Appl Microbiol Biotechnol，2007.74(5)：1126-1134；[9]Kalyuzhnaya，M.G.，et al.，Fluorescence in situ hybridization-flowcytometry-cell sorting-based method for separation and enrichment of type I and type IImethanotroph populations.Appl Environ Microbiol，2006.72(6)：4293-4301)。