[发明专利]能在芽孢表面展示PA20蛋白的炭疽芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株能在芽孢表面展示PA₂₀蛋白的炭疽芽孢杆菌及其应用。 

911事件之后的炭疽芽孢袭击事件，引起了人们对生物武器的恐慌。炭疽杆菌形成的芽孢具有存活时间长，易于传播，引起的炭疽杆菌病发病时间快和死亡率高等特点，在我国被列为乙类传染病，是恐怖主义者首选武器之一。 

炭疽杆菌毒性菌株含有两个大质粒，分别是编码毒素基的pXO1质粒(184.5kbp)，合成荚膜相关基因的pXO2质粒(95.3kbp)。强毒株需要两种质粒的存在，缺少pXO1则不产生毒素，即为弱毒菌；缺少pXO2则不形成荚膜，比野生型菌毒力低百倍，因此炭疽杆菌致病因子主要是荚膜和炭疽毒素两个方面，而能够引起机体对其产生免疫保护应答的成分岂今发现主要是炭疽毒素中的保护性抗原（PA），另外炭疽杆菌的芽孢成分、水肿因子（EF）及致死因子（LF）均有增强免疫保护的作用。我国当前应用于疫苗的A16R株是只具有pXO1大质粒的弱毒株，但残留一定的毒性，存在一定的副作用等缺点。我们已经消除pXO1毒性质粒，建立“无毒”的炭疽杆菌芽孢突变株，并且获得专利(专利号：ZL200610007229.3)。 

根据PA蛋白的晶体结构,可将其分成4个结构域:结构域1(PAD1)由1～258氨基酸残基组成,其中PA₂₀成熟蛋白序列为第20～186氨基酸残基，PAD1含有弗林蛋白酶(furin)的切割位点和LF及EF的结合位点;结构域2(PAD2)由259～487氨基酸残基组成,参与蛋白七聚体的形成及LF、EF进入细胞质孔道的形成;结构域3(PAD3)由488～595氨基酸残基组成,参与七聚体的形成;结构域4(PAD4)由596～735氨基酸残基组成,为细胞受体结合结构域。PAD1包括furin蛋白酶的作用位点和EF/LF的结合位点,抗PA₂₀抗体能阻止LF或EF与PA结合，从而阻止LF或EF进入细胞内。 

本发明的目的是提供一株能在芽孢表面展示PA₂₀蛋白的炭疽杆菌突变株及其应用。 

本发明所提供的能在芽孢表面展示PA₂₀蛋白的炭疽杆菌株，是将pagA₂₀基因插入到炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）芽孢蛋白bclA基因未端获得的菌株。 

所述pagA₂₀基因编码的蛋白具有自GeneID:2820165的5＇端第20-186位氨基酸序列；所述bclA基因具有自GeneID:62823670的5＇端第1-389位核苷酸序列。 

所述能在芽孢表面展示PA₂₀蛋白的炭疽芽孢杆菌株还经过去除构建过程中引入的 抗生素标记。 

所述炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）为减毒活疫苗菌株，具体为炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）AP422CGMCC№.1569。 

所述能在芽孢表面展示PA₂₀蛋白的炭疽芽孢杆菌株优选为炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）AP423CGMCC№.3403。炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）AP423CGMCC№.3403是通过同源重组将pagA₂₀基因插入到炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）芽孢蛋白bclA基因未端，并采用重组酶将引入的卡那抗性基因敲除，通过大量鉴定筛选获得的一株能在芽孢表面展示PA₂₀蛋白，并且无抗生素标记的炭疽芽孢杆菌株。 

所述炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）AP423，已于2009年11月05日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路），保藏号为CGMCC№.3403。 

本发明还提供一种能在芽孢表面展示PA₂₀蛋白的炭疽芽孢杆菌株的获得方法，是将将pagA₂₀基因插入到炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）芽孢蛋白bclA基因未端。