[发明专利]一种编码溶菌酶的基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的编码溶菌酶的基因，特别是涉及克隆自环境宏基因组的一种新的编码溶菌酶的基因lyase，该基因编码的蛋白质可用于抗菌和溶菌。

背景技术

溶菌酶又称胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，其化学名称为N一乙酰胞壁质聚糖水解酶。

溶菌酶具有多种独特而重要的药理作用。它具有抗菌消炎的作用。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还能增加抗生素和其他抗菌药物的疗效，改善组织基质的黏多糖代谢从而达到抗炎和修复的目的。此外溶菌酶也能抗病毒，它与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用(余若黔.2004.溶菌酶的活性测定方法.生物技术通报.(5)：40-42.)。同时由于溶菌酶本身是一种无毒、无害的蛋白质，可以选择性地、有目的地杀灭微生物而不作用于食品中的其他物质，保证食品原有营养成分不受损失。因此，它是一种很好的天然防腐剂，在食品工业中可以安全地替代有害人体健康的化学防腐剂，如苯甲酸及其钠盐等，以达到延长食品保质期的目的。张凤凯等人利用溶菌酶作为主要成分，成功研制了一种纯天然的冷却肉保鲜剂-Hnsafety2008冷却肉保鲜剂，该保鲜剂可以延长冷却肉的保质期1～4倍(张凤凯，马美湖.2001.溶菌酶及其食品保鲜剂的应用.肉类研究，20(4)：41-42.)。同时溶菌酶也是一种安全性高的饲料酶添加剂，可以用作饲料防腐剂和杀菌剂。沈彦萍等人将溶菌酶用到仔猪腹泻的防治上，发现溶菌酶具有显著的作用，可以达到抗生素的使用效果，仔猪腹泻的治愈率达80％以上(沈彦萍，陈宇光，潘宏涛，等.2005.溶菌酶可溶性粉剂防治仔猪腹泻的效果观察.饲料工业，26(3)：16～181)。

目前国内外对溶菌酶基因研究主要集中于动物，如人(Chen ZH，Xie XD，Guo TK，et al.2007.Theanti-proliferativeeffectsofrecombinant human lysozyme onhuman gastric cancer cells.The Jourmal Of Intermational Medical Research，35(3)：360.)、鸡蛋清(权志中、张丞斌、余荣等.2007.鸡蛋清溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达研究.28(24)：18-22.)、大鼠(Yamaokaky，Yoshiokat.1983.Effects of lysozyme chloride on immune responsesof patients withuterinecervical cancer.Gan to kagaka kyoho，10(8)：8-20.)的溶菌酶上，对这些不同动物来源的溶菌酶基因进行研究和应用。而通过建立环境样品的宏基因组文库克隆各种基因已经成为筛选和获得各种特殊作用的新基因的有效方法(Lorenz P.Schleper C.2002.Metagenome-a challenging source of enzymediscovery.Journal ofMolecular Catalysis B：Enzymatic 19-20：13-19.)。

发明内容

本发明通过构建土壤微生物的宏基因组DNA文库和文库亚克隆序列的随机测序法，得到了新的编码溶菌酶的基因，可在宿主细胞中大量表达该基因以生产该溶菌酶，用于溶菌和抗菌。

本发明涉及一种新的编码溶菌酶的基因lyase，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列，是从广西武鸣县糖厂周围土壤微生物宏基因组文库中分离得到。土壤微生物的文库中的亚克隆、具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列的外源DNA是由1977个碱基组成，含有完整的溶菌酶基因lyase的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，lyase基因的起始密码为ATG，终止密码子为TAA。

SEQ ID NO.2的蛋白质是基因lyase编码的溶菌酶产物Lyase，由659个氨基酸组成，和Lyase催化功能域同源性最高的为亚硝化海洋球菌ATCC19707(Nitrosococcus oceani ATCC 19707)的hypothetical protein Noc_2530的催化功能域(e-值为1e-75)，两者的相似性为32％、相同性为48％。