[发明专利]鱼肉制品中安康鱼种源的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于鱼肉制品中物种来源鉴定的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品中安康鱼的快速检测方法。

背景技术

海洋捕捞的海洋大型鱼类一直是世界各国人民喜爱的食品，也是国际贸易的重要商品种类。海洋大型鱼类在贸易中常常包括加工成鱼肉片或者鱼肉块，更包括一些鱼的内脏或者其他深加工的产品。这些产品从外观上已经不能看出用来加工的原料鱼种类，因此需要不受外观和加工工艺的限制来确认商品的真伪。

基于DNA的检测方法可以从基因水平进行物种鉴定。实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为基因检测和鉴定的重要工具。目前国内外还没有对安康鱼物种的鉴定方法公开，本发明可弥补上述缺陷，完成鱼肉制品中安康鱼种源的鉴定。

发明内容

本发明属于鱼肉制品中物种来源鉴定的检测技术，具体地说是用实时荧光PCR技术检测食品中安康鱼的快速检测方法。克服基于形态学的检测方法在鱼类产品加工过程中带来的鉴定困难，为确定安康鱼的种源提供技术手段，从而确保食品标签的一致性。

本发明的主要原理为：针对保守序列设计一组引物：上游引物AnkangF106：5-TTTATTCGTATGGGCTGTT-3；下游引物AnkangR106：5-GGTGTTTAGGTTTAGGTCT-3。利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行PCR扩增；测定熔解曲线时，在反应体系中加入荧光染料Eva Green，染料与DNA双链结合并发出荧光，由于反应中存在少量的非特异聚合体(如引物二聚体等)，能引起干扰，但非特异聚合体的熔解温度较特异性结合低，当扩增结束后，再缓慢加温，当DNA变性后，染料被释放，荧光减少，而非特异性结合先于特异性结合减少，对熔解过程进行连续动态监测可得熔解曲线，通过曲线将非特异性讯号和特异性讯号区分出来，同时对特异性讯号区，荧光减少的快慢与浓度的对数成正比，以此可以确定是否有引物特异性扩增产物。

本发明涉及的安康鱼种源快速检测方法，其中的试剂包括如下：

(1)PCR扩增反应液

包括10×PCR反应缓冲液、0.1-0.4mmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、1-2U Taq酶、0.2-0.6μmol/L上游引物、0.2-0.6μmol/L下游引物、1.25μL 20×Eva Green染料(美国Biotum公司)；

其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X-100；

上游引物AnkangF106：5-TTTATTCGTATGGGCTGTT-3；下游引物AnkangR106：5-GGTGTTTAGGTTTAGGTCT-3。其中上游引物、下游引物体积比为：1∶1；

使用上述试剂盒检测食品中安康鱼种源的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)：

(1)待检样品DNA的提取

DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。DNA提取质量使用OD₂₆₀和OD₂₈₀的光吸收来衡量，或者使用其他方法衡量。

(2)安康鱼种源的实时荧光PCR扩增

A.在装有24μL PCR扩增反应液A的反应管中加入1μL待检样品DNA，混匀。

B.检测过程中分别设阳性对照、空白对照。使用具有溯源性的阳性标准物质作为阳性对照，用已知不含鱼类成分的样品作阴性对照，用等体积的水代替模板DNA作空白对照。

C.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

94-95℃  2-4min，1个循环；

94-95℃  30s，65℃ 30s，75℃ 30s，共45个循环；

95℃ 15s，60℃ 15s，20min内升温至95℃，95℃ 15s。

(3)使用熔解曲线分析PCR扩增结果。

非安康鱼样品：熔解曲线在81±0.5℃无单一峰；安康鱼样品：熔解曲线在81±0.5℃有单一峰。

本发明建立了安康鱼种源的实时荧光PCR检测方法及检测方法。本发明采用实时荧光PCR技术，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，特别适用于一些成分复杂的鱼肉制品中安康鱼种源的检测。

附图说明