[发明专利]甲鱼虹彩病毒的环介导等温扩增检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病毒的检测方法和检测试剂盒，特别是涉及甲鱼虹彩病毒(STIV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法和试剂盒。

背景技术

虹彩病毒(Iridovirus)是一类对鱼类、两栖类和爬行类水生动物具有广泛感染性的致病病原，由虹彩病毒所致疾病给世界水产养殖业造成了巨大的经济损失。近年来，许多国家相继报道了在患病鱼、蛙和龟等水生经济动物中分离到虹彩病毒。虹彩病毒科(Iridovirudae)分为5个属：虹彩病毒属(Iridovirus)、绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)、蛙病毒属(Ranavirus)和淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)、肿大细胞病毒属(Megalocytivirus)(也称细胞肥大病毒属)。

甲鱼虹彩病毒(STIV)又称中华鳖病毒，属于虹彩病毒科蛙病毒属病毒。病毒呈典型的虹彩病毒形状，大小为直径120-160nm。病毒能在CO、CK、BF-2、EPC和FHM等细胞株上增殖，但不能在CHSE、R1、RTG-2、PG等细胞株中增殖。病毒的最适复制温度为25-30℃，病毒对氯仿、酸性条件(pH3)、碱性条件(pH10)以及高温(60℃，30min)敏感，IUDR(5-iodo-2-deoxyuridine)能抑制病毒的复制。病毒人工感染健康中华鳖，发病死亡率超过40％(Chenet al.，1999)。

甲鱼虹彩病毒的诊断方法有：细胞分离培养、电镜观察、免疫学方法、分子生物学等方法，各有优缺点。细胞分离培养被认为是病毒分离鉴定的黄金法则，可靠性强但操作时间较长：电镜观察在水生动物的病毒鉴定中一直扮演着非常重要和直观的角色，通过对感染病毒的细胞或组织(肝、脾、肾、脑等)电镜观察不但可以看到直接的包涵体和病毒的形态特征，对病毒进行初步的分类和诊断，同时，还可以通过对不同感染阶段的连续电镜观察，了解病毒在宿主组织里的增殖过程和增殖方式；免疫学方法包括中和实验、间接荧光抗体试验(IFAT)和酶连免疫试验(ELISA)。分子生物学方法如PCR和实时荧光PCR目前被广泛应用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是日本学者Notomi等于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其原理是针对靶基因的6个区域，设计4条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶-Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase，在恒温63℃左右反应1h，即可完成核酸扩增反应，通过直接观察反应产物的颜色可以进行结果判定。LAMP技术因其具有高特异性、高效率和快速反应的特点，目前被广泛应用于动植物及人类病原体的检测。在水生生物的病原检测方面，LAMP已经应用于检测迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellaictaluri)(Yeh et al.，2005)；对虾白斑综合征病毒(WSSV)；锦鲤疱疹病毒(KHV)(Gunimaladevi et al.，2004)、虹彩病毒(RSIV)；传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)(Gunimaladevi etal.，2005)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)(Soliman and El-Matbouli，2006)；鲤春病毒血症病毒(SVCV)(Liu et al.，2008；Shivappa et al.，2008)等。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种甲鱼虹彩病毒(STIV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。

本发明的另一目的在于提供一种甲鱼虹彩病毒(STIV)的检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种甲鱼虹彩病毒(STIV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法，所述方法包括利用特异性引物，以病毒核酸为模板进行环介导等温扩增反应，所述特异性引物包括一对内引物和一对外引物，所述外引物分别含有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的序列，

Seq ID No.1：

正向外引物(F3)：5’-CGTTTAGCGGCAACATTGG-3’；

Seq ID No.2：

反向外引物(B3)：5’-TTTCTTTGCGGCC CTCTG-3’。

所述内引物分别含有Seq ID No.3和Seq ID No.4所示的序列，

Seq ID No.3：正向内引物(FIP)：