[发明专利]一种肝素钠中多硫酸软骨素的分离、检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及肝素钠中多硫酸软骨素的预处理和电泳检测方法。

背景技术

我国是肝素钠产量最大的国家，国际市场的肝素钠产品原料70％以上均来自中国。随着需求的增加，肝素钠的价格这几年一路攀升。2008年2月，美国因注射肝素钠出现4例死亡，多例不良反应的医疗事故，成为震惊世界的“肝素钠事件”。经有关专家分析，上述事故可能是因为与肝素钠中含有多硫酸软骨素有关联。我国政府十分重视并关注事态发展，针对市场中存在部分肝素钠中含多硫酸软骨素情况，国家药监局召开专门会议，要求加强管理，一律召回含有多硫酸软骨素的肝素钠。因此，对肝素钠中多硫酸软骨素进行检测已经成为迫在眉睫的事。

目前，行业内肝素钠中多硫酸软骨素的检测，一般采用核磁共振法、醋酸纤维素薄膜电泳法。核磁共振法检测设备投入大，而且多硫酸软骨素含量少于1％时也不易被检出。而醋酸纤维素薄膜电泳检测法，分离效果差，容易受其它杂质干扰，薄膜不透明，不易于观察，通常肝素钠中多硫酸软骨素的含量大于5％时，电泳检测效果明显，而当多硫酸软骨素小于3％时电泳检测结果不容易辨别(导致这些产品流入市场)。本申请人同日提交的发明专利申请，公开了一种肝素钠中多硫酸软骨素的琼脂糖凝胶电泳检测方法，即使肝素钠中的多硫酸软骨素含量少于1％也能被检出，检测结果容易观察，分辨率高，检测灵敏度高。但当肝素钠中的多硫酸软骨素含量少于0.5％时，该方法仍不能有效检出。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种肝素钠中多硫酸软骨素的分离、检测方法，即使肝素钠中的多硫酸软骨素含量少于0.5％时，仍能有效检出，检测结果容易观察，分辨率高，检测灵敏度高。

本发明采取以下技术方案予以实现：

一种肝素钠中多硫酸软骨素的分离、检测方法，包括下列步骤：

(1)肝素钠中多硫酸软骨素的分离制备：

a、溶解过滤：将含有重量低于0.5％多硫酸软骨素的肝素钠样品，加入氯化钠溶液中，升温至55℃±5℃，搅拌使肝素钠完全溶解，再用碱溶液调PH至10-12，过滤收集滤液，并将滤液降温至溶液的冰点至5℃，用酸调PH至1-2，过滤收集滤液；

b、快速沉淀：滤液用碱调PH至5-6，搅拌下缓慢加入酒精，使溶液含酒精的重量浓度为30-38％，静置；用搅拌棒试探容器底部，只要有沉淀沉底，即可以将上层酒精倒出，收集沉淀物，烘干即得多硫酸软骨素、肝素钠、杂质的混合品；

(2)样品准备：将相同重量的步骤(1)含有重量低于0.5％多硫酸软骨素的肝素钠样品、步骤(1)制得的沉淀物，以及肝素钠标准品、多硫酸软骨素标准品分别溶解于水中；对制得的水溶液分别加酸调PH至1-3，然后用亚硝酸盐或硝酸盐进行硝化反应0.5-2小时，再调PH至6.5-7.5，备用；

(3)多硫酸软骨素的检测：

c、制胶板：用琼脂糖溶液与电泳缓冲液混合，其混合体积比为1∶0.7-1.5，并加热使其溶解，趁热将胶液倒于大小适宜的玻板上，静置，待凝胶结成无气泡的均匀薄层；

d、电泳：在电泳槽内加入电泳缓冲液，将凝胶板置于电泳槽架上，浸入缓冲液；取步骤(1)准备好的四种样品水溶液，于凝胶板负极端分别点样，立即接通电源，在设定的电压梯度、电流强度的条件下电泳；

e、染色和脱色：取下凝胶板，用染色液染色，再用水洗去多余的染色液至背景无色为止；

f、结果观察：观察样品和标准品所显示的迁移距离。

本发明进一步改进方案是，所述电泳缓冲液为醋酸-锂盐缓冲液，缓冲液pH值为2.0-4.0。

本发明更进一步改进方案是，四种样品溶液的点样量分别为0.5-1.5μl。电泳时的电压梯度为25-35V/cm，电流强度为1-2mA/cm，电泳时间为15-20分钟。

本发明的有益效果：

一、本发明用快速沉淀法将多硫酸软骨素与肝素钠分离，并进一步对分离所得物进行检测，实现了对肝素钠中含量较低的多硫酸软骨素的检测，灵敏度达到0.1％以上。

二、本发明所制备的琼脂糖凝胶厚薄均匀，含水量大(约占98％-99％)，近似自由电泳，样品扩散性好，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。

三、琼脂糖透明无紫外吸收，琼脂糖胶板呈透明状，易于观察，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测、观察，观察直观，容易判断。

四、电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定，且制成干膜可长期保存。

五、本发明操作简单，电泳速度快。

附图说明