[发明专利]一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程中分子生物学蛋白加工技术领域，具体涉及一种利用 大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方法。

背景技术

现有技术利用大肠杆菌表达外源蛋白主要包括克隆目的基因、构建重组表 达质粒转化表达菌、诱导表达、蛋白提取、活性鉴定等步骤，其中诱导表达和 蛋白提取是精髓所在，但是存在成本高，操作复杂，生产周期长，而且蛋白表 达率低、活性差，不易纯化、较易降解的不足。为此，本发明人经过潜心研究， 研制开发了一种利用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白的方法，试验 证明，应用效果良好。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供了一种成本低、操作简 单、生产周期短、适于大规模生产、蛋白表达率高、易于纯化、不易降解的利 用大肠杆菌表达烟草富含甘氨酸RNA结合蛋白(GRP)的方法。

本发明的目的是实现的：包括表达菌株筛选、培养基优化、蛋白提取缓冲 液配制，其特征在于：具体包括下列工序：

A、提取烟草总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增出GRP蛋白基因；

B、构建重组表达质粒pGEX4T-1-GRP；

C、转化大肠杆菌表达菌株、小量诱导筛选高效表达菌株、大量诱导表达： 用阳性pGEX4T-1-GRP质粒转化的大肠杆菌表达菌rosetta，涂培养基LinA平板， 37℃恒温培养箱培养约15小时至长出单克隆，用牙签挑10个克隆菌株分别做 好标记，各克隆菌株的一半分别放入2ml培养基LinA中，于37℃摇约4-5小 时至OD₆₀₀＝0.5，每管取出200μl作为阴性对照，剩余加终浓度为0.5mM的异丙 基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG，于37℃下诱导两小时后所有管取200μl，同两小 时前取出的阴性对照一起SDS-PAGE；选择表达量最好的克隆，从板上挑剩余 的一半接种入100ml培养基LinA中，于37℃振摇培养15小时；按1∶100转 接入1L培养基LinA中，摇约2小时至OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG于37℃下诱导，2小时后离心收集菌体，并用 缓冲液10xA洗一次，沉淀物冷冻于-80℃冰箱中备用；

所述的培养基LinA由8-12g的胰蛋白胨Trypton、1-3g的酵母抽提物Yeast  extracts、4-6g的氯化钠Nacl、80-120ml的缓冲液10xA和1000ml双蒸水配制而 成；所述的培养基LinA使用前加入经过滤除菌的浓度0.5％的葡萄糖；

所述的缓冲液10xA由380-420mM的磷酸钾K2HPO4、150-250mM的磷酸 氢钾KH2PO4、70-90mM的硫酸铵(NH4)2SO4和16-20mM的柠檬酸钠Sodium  Citrate配制而成；

D、蛋白提取：将诱导表达收集的菌体从-80℃冰箱取出置于冰上或4℃冰箱 中约半小时至溶化；按质量体积比1∶10的比例加入缓冲液TKM，涡旋震荡混 匀，加入100倍的苯甲基磺酰氟化物PMSF、溶菌酶、1000倍的二巯基苏糖醇 DTT后于冰上磁力搅拌半小时；然后再加入PMSF、DTT，于180HZ超声波间 歇破碎1min，最后加脱氧核糖核酸酶DNase消化10min，于12000rpm离心分 离40min，上清液加入PMSF和DTT，即可上纯化柱体纯化蛋白；所述的缓冲 液TKM由8-12mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液Tris-HCl、40-60mM氯化 钾KCl、8-12mM的醋酸镁Mg(AC)₂配制而成；

E、蛋白活性鉴定。

本发明通过筛选大肠杆菌高效表达菌株，优化培养基，克隆基因构建出GRP 基因重组表达质粒pGEX4T-1-GRP，再用阳性质粒对菌种为Rosetta的大肠杆菌 菌株进行转化，并采用优化的专用培养基LinA培养、缓冲液TKM，筛选出了 高效表达菌株，从而提高了烟草中富含甘氨酸RNA结合蛋白的表达效率。本发 明具有成本低、操作简单、生产周期短、适于大规模生产、蛋白表达率高、活 性强，易于纯化、不易降解的优点。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限 制，任何基于本发明教导所作的变换均属于本发明的保护范围。