[发明专利]一种检测结核分枝杆菌感染的试剂、方法及应用

说明书

技术领域

本发明属生物医学检验领域，涉及微生物分子生物学检测方法，具体涉及一种检测结核分枝杆菌感染的试剂、方法及应用。

背景技术

结核病是当今全球面临的主要公共健康问题之一，它的病原体是结核分枝杆菌，属分枝杆菌属。近年来，由于耐药结核病、人类免疫缺陷病毒(HIV)合并结核分枝杆菌感染、大规模人口流动等问题的出现，结核病疫情出现加重的趋势。据调查报道，全球每年约有900万人发展成活动性结核，200万～300万人死于结核病。我国是全球22个结核病高负担国家之一，有结核病患者450万，其中开放性肺结核患者高达200万。据估计，我国每年新发肺结核145万，约有13万人因结核病死亡。结核病已成为引起成年人死亡的头号传染病。据WHO报道，全球三分之一的人口(约20亿)已感染了结核杆菌，如不采取措施，近10年内还将有约3亿人受结核杆菌感染。

特异性抗原诊断一直是确认病原体感染及评估感染状况较为可靠的方法，且有早期诊断价值，其已经在HBV、HCV、HIV等疾病的诊断方面获得了广泛的应用。由于人体在对抗结核分枝杆菌的感染中，细胞介导的免疫反应起到了关键性的作用，所以寻找结核杆菌特异性的T细胞抗原和检测T细胞免疫反应已经成为近年来研究热点。一种以T细胞为基础的γ-干扰素释放实验(Interferon-γRelease Assay，IGRAs)得到了较为广泛的应用，其原理是受到结核分枝杆菌抗原刺激而致敏的T细胞，再次遇到同类抗原时能产生γ-干扰素，对全血或分离的外周血单核细胞在结核分枝杆菌特异性抗原刺激后产生的γ-干扰素进行检测，就可以反映机体是否存在潜伏性的结核感染。目前获得商品化应用的IGRAs主要有2种方法，一种称为QuantiFERON(QFT)-TB GOLD试验(Cellestis，Victoria，Australia)，另一种称为T-SPOT.TB试验(Oxford Immunotec，Oxford，UK)。这两种检测方法所采用的结核分枝杆菌特异性的抗原为ESAT-6(early secreted antigenic target 6)和CFP-10(culture filtrate protein 10)，其编码基因位于RD1(Region ofDifference 1)区，RD1在BCG和绝大多数非结核分枝杆菌的基因组中是缺失的，理论上可以避免上述在TST中影响特异性的PPD交叉抗原反应，能够较好地区分真性结核感染和BCG接种诱导的反应。

但上述ESAT-6、CFP-10抗原属于结核杆菌早期分泌蛋白，主要在结核杆菌的快速生长期分泌，而在结核持续感染中分泌量减少，导致检测的敏感性不足，局限了该试剂的推广。另有研究显示上述两种IGRAs试剂在发展中国家的效果并不理想，推测可能与发展中国家非结核分支杆菌的感染率较高有关。此外该两种IGRAs试剂价格较昂贵，在发展中国家难以得到广泛应用。

随着结核分枝杆菌全基因组测序的完成，其基因组与BCG基因组之间的差异也被揭示。通过比较基因组学，可以得到结核杆菌基因在BCG中缺失的部分，称为RD区。RD区中的基因，特别是那些同时在非结核分枝杆菌中也缺失的基因，它们所编码的蛋白成为寻找新的结核杆菌特异性抗原的首选。除RD1区的ESAT-6和CFP-10外，多种RD区蛋白被证明具有较高的诊断价值，如RD2区的Rv1980(MPT64)，Rv1984(Cfp21)，Rv1985c及RD11区的Rv3425，Rv3429等。但部分具有较强免疫原性的RD区抗原仍与BCG和非结核分枝杆菌之间存在交叉反应，影响的诊断的特异性。有关研究认为，通过进一步对这些蛋白的T细胞抗原表位进行分析，并除去与BCG有交叉反应的部分，将可以得到具有较高敏感性和特异性的多肽或混合物用于结核病的诊断。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的缺陷，提供一种新的检测结核分枝杆菌感染的试剂。

本发明公开了一种新的结核分枝杆菌检测试剂，其含有SEQ ID NO.1-10代表的多肽或其类似物。它能有效地检测活动性结核病和结核潜伏感染，同时它不受BCG疫苗和非结核分枝杆菌感染的干扰。

本发明的另一个目的是提供一种新的检测结核分枝杆菌感染的方法，本方法基于细胞介导的免疫反应，使用单个或多个SEQ ID NO.1-10的多肽与结核杆菌宿主的T细胞相接触，通过检测激活T细胞释放的细胞因子，确定T细胞是否识别该多肽。

本发明的目的还在于进一步提供基于上述多肽的诊断试剂盒和其应用。