[发明专利]诱导马尾松未成熟种子胚性胚柄细胞团再生植株的方法

说明书

一、技术领域

本发明属林业中的种苗繁殖生物技术领域，具体涉及一种诱导马尾松优树未成熟种子胚性胚柄细胞团(Embryonal Suspensor Mass，简称ESM)再生植株的方法。

二、背景技术

马尾松(Pinus massoniana)是我国南方的主要用材树种之一，分布范围广、蓄积量大。由于它的适应性强、生长快、用途广泛、造林更新容易、成本低，在绿化荒山、改善生态环境方面起了很大的作用。与商品材杉木和北方红松相比，马尾松在弯曲强度、弯曲弹性模量、顺纹压力、端面硬度4个指标上都超过杉木、红松；而且其木材纤维素含量较高，木材广泛用于建筑、板材、家具、胶合板、造纸和木纤维工业。马尾松木材很耐水湿，素有“水浸千年松”之说，适于水底地下工程，大量用于矿柱和桩木；松脂的主要成份是松香和松节油，是重要的天然化工原料，马尾松还是我国主要的产脂树种，产脂期长，产量高，单株立木胸径18cm以上，每年可割脂5～6kg；马尾松木材含纤维素62％，脱脂后是造纸和人造纤维工业的重要原料；利用松根、弯曲木可培养名贵的中药材茯苓，等等。因此，加强对马尾松现有林分的保护，研究、保护马尾松的遗传资源和发展马尾松人工林资源具有的重要意义。

在马尾松森林资源的培育中，采用遗传改良材料种植是营林成功的关键措施之一。马尾松良种繁育目前主要采用种子园育种、优树无性系扦插繁殖等传统方法，繁殖速度较慢，难以满足生产应用的需求。

被子植物体胚的发生和植株再生的思想，源于1902年Haberlandt提出的植物细胞具有全能性的概念，即植物体的每一个细胞都具有发育成为一个新个体的潜在能力。在人工培养条件下，植物体细胞可以诱导分化形成如有性生殖合子胚那样的胚状结构(胚状体)，进而通过覆被人工胚乳形成人工种子或直接再生形成完整的植株。由于植物每一个体细胞从理论上都存在诱导成胚的可能性，且繁殖速度快、不受地区、季节和灾害性气候等自然条件的限制；对于木本植物来说，不必等待漫长的有性世代，也不必像常规的无性繁殖那样需要充足的萌芽插条，一旦获得优良的材料，就可以比常规繁殖快数十倍甚至上百倍的速度繁殖优良种苗。

作为裸子植物的马尾松，体胚的发生与被子植物的体细胞胚发生有着完全不同的途径和机理，成熟的种子以及由种子发育而来的植株，营养细胞转变为胚性细胞十分困难。但在针叶树种中，雌配子体受精后发育成种子的过程中有一部分珠心细胞处于未分化的阶段，在适当的培养条件下，可以利用裂生多胚特性，诱导体胚形成。Gupta等(1985，1995)报道过利用这一生物学特性，诱导出花旗松(Pseudotsuga menziesii)和湿地松(Pinus elliottii)的体胚，其大致可以分为四个步骤：ESM的诱导、保持和增殖、体胚的成熟、萌发和植株再生，并证明该技术体系具有达到产业化的前景。

目前虽有马尾松成熟种子诱导体胚发生的报道，但诱导率极低，难以在生产上应用。中南林业科技大学曾报道马尾松不同成熟度的幼胚离体培养，诱导愈伤组织和体胚发生，但尚未获得具体的结果。国内外尚无利用马尾松优树未成熟种子的ESM诱导体胚发生，并实现植株再生的成功方法报道。

三、发明内容

本发明的目的是针对当前马尾松组织培养器官发生困难、植株再生率低，以及用马尾松的成熟合子胚诱导体胚成功率极低，难以满足生产应用需要等问题，研究利用马尾松优树的ESM诱导体细胞胚的发生和植株再生的新途径，快速生产大批高质量的苗木，满足林业生产对优质马尾松种苗的需求。

本发明以马尾松优树未成熟种子的ESM为起始材料，在经过反复筛选的基础上获得培养基上进行多步离体培养，长期维持未成熟种子ESM的裂生多胚发生能力，经过胚性愈伤诱导、维持、增殖、体胚成熟前期和成熟等阶段培养，获得体胚，再经萌发培养实现植株的再生。

本发明的技术解决方案为：

一种诱导马尾松优树的未成熟种子ESM再生植株的方法，其特征是在每年的6月中旬采集马尾松优树球果，置于4℃冷藏保存预处理一周以上后，在无菌条件下剥取球果中的未成熟胚，按以下培养条件和先后时间顺序培养：

a.ESM的起始诱导

此阶段基本培养基采用DCR培养基。在无菌条件下将未成熟种子胚接种至下述诱导培养基中，在23℃、暗培养40天，诱导获得大量ESM，培养基配方如下。

KNO₃                      340mg/L